Schlüsselwörter
(Deutsch)
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Tritrichomonas fœtus, Katze, Rinder, PCR, Genomanalyse
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Schlüsselwörter
(Englisch)
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Tritrichomonas fœtus, cat, bovines, PCR, genome analysis
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Kurzbeschreibung
(Deutsch)
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Tritrichomonas fœtus (T. foetus) gilt in der Schweiz beim Rind als eine auszurottende Tierseuche. Am Institut für Parasitologie Bern (IPB; Referenzlabor für Tritrichomonose beim Rind) werden im Rahmen der vorge-schriebenen, routinemässigen Überwachung von KB-Stieren jährlich rund 1000 Untersuchungen auf T. foetus beim Stier durchgeführt. In den letzten 12 Jahren liess sich dabei der Erreger nie nachweisen (letzter Fall 1997, Felleisen). Weibliche Tiere und Stiere, die nicht zur KB eingesetzt werden, werden nur bei klinischem Verdacht auf eine T. foetus Infektion untersucht. Die Anzahl dieser Untersuchungen ist erfahrungsgemäss sehr klein (ca. 5-10 Untersuchungen pro Jahr).
Zuerst aus den USA, dann aus England und mittlerweile aus mehreren europäischen Staaten liegen Berichte von chronischen Durchfällen bei Katzen vor, die durch Trichomonaden verursacht werden (Gookin et al. 2001, Gunn-Moore et al., 2007, Dahlgren et al., 2007; Frey et al., 2009). Die Symptome einer intestinalen Trichomonose der Katze sind hartnäckige Dickdarmdurchfälle, die nur mit Ronidazol zu therapieren sind (Gookin et al., 2006). Trichomonaden werden mit den gängigsten koprologischen Untersuchungsmethoden (Flotation, Sedimentation und SAF) nicht erfasst. Der sicherste Nachweis gelingt über eine kulturelle Ver-mehrung der Erreger und/oder über den DNA-Nachweis mittels PCR (Gookin et al., 2002 und 2003). Die vorläufige Spezifizierung des Erregers bei der Katze mittels Sequenzierung eines DNA-Locus ergab bisher immer vollständige Homologie mit T. foetus des Rindes.
Das IPB als Referenzlabor für Trichomonose des Rindes war natürlich sehr daran interessiert zu erfahren, ob auch Katzen in der Schweiz Träger und Ausscheider von Trichomonaden sind. Da sowohl die Trichomo-naden-Kultur wie auch eine PCR zum Nachweis von Trichomonas-DNA am IPB etabliert sind konnten wir gezielt 52 Katzen, welche an chronischen Durchfällen leiden, auf das Vorliegen einer Infektion mit Trichomo-naden untersuchen. 12 dieser Katzen waren positiv und die Sequenzierung entsprechender diagnostischer PCR-Produkte ergab immer T. foetus (Frey et al., 2009). Gesamthaft wurden am IPB in den Jahren 2007 und 2008 179 Untersuchungen auf T. foetus bei der Katze durchgeführt wovon 41 Untersuchungen, d.h. 23%, positiv ausfielen.
Ein wesentlicher Nachteil aller bisher durchgeführten Studien ist, dass mittels PCR jeweils nur ein Genlocus amplifiziert wurde. Die Loci, die angeschaut wurden, liegen alle auf den Genomsequenzen für rRNA (ITS 1 und 2, 5.8S und 18S rRNA Gene). Es ist jedoch z.B. anhand von Giardia lamblia nachgewiesen worden, dass die Analyse eines Locus nicht ausreicht um definitiv sagen zu können, dass zwei Isolate wirklich zur selben Spezies gehören, insbesondere dann nicht, wenn sie aus verschiedenen Wirtstierspezies stammen (Wielinga et al., 2007; Robertson et al., 2007). Vergleichende Studien zur weiteren und genaueren Genotypisierung der verschiedenen Tritrichomonas-Isolate aus Rind und Katze fehlen zur Zeit noch.
Die Bedeutung der Trichomonadenfunde bei Katzen für die Rinder ist zur Zeit noch unbekannt. Eine neuere Publikation aus den USA beschreibt nun die exprimentelle Infektion von Rindern mit einem Katzenisolat und zeigt, dass der Erreger beim Rind infektiös ist und Vaginitis und Endometritis verursachen kann (Stockdale et al., 2007), wenngleich die histopathologischen Veränderungen nicht dieselben waren wie nach Infektion mit einem Rinderisolat von T. foetus. Auch hier besteht weiterer Forschungsbedarf, deuten doch diese ers-ten Versuche darauf hin, dass Unterschiede zwischen den beiden Isolaten bestehen könnten.
Zusammenfassend sind die sich aufdrängenden Fragen wie folgt: Handelt es sich bei T. foetus des Rindes und T. foetus der Katze wirklich um denselben Erreger, und was ist die Bedeutung der Funde bei Katzen für das Rind? Sind die Katzenisolate infektiös für Rinder? Sind sie auch rinderpathogen?
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Kurzbeschreibung
(Englisch)
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Tritrichomonas foetus is an important veneral cause of infertility and abortion in naturally bred cattle in many countries, and a notifiable disease in Switzerland (according to the O.I.E. list). Trichomoniasis in cats, characterized by chronic diarrhea, is a relatively novel, emerging disease that has increasingly attracted the attention of researchers and companion animal practitioners (Gunn-Moore et al., 2007; Dahlgren et al., 2007; Frey et al., 2009). So far, molecular speciation of these organisms in cats has detected complete homology with T. foetus isolates of cattle (Frey et al., 2009). However, only one single gene-locus has been analyzed so far, and such an approach, as shown in the case of Giardia lamblia and other protozoans proved to be insufficient for correct speciation, most notably when parasites were isolated from different host-species (Wielinga et al, 2007; Robertson et al., 2007).
In this study, we will investigate whether the organisms isolated from cats belong to the same species as the ones isolated from cattle. The results will help to improve the risk-assessment for cattle.
Two methodological approaches will be used
- Genotyping with PCR, based on different loci in the trichomonad-genome such as triose-phosphate-isomerase (tpi), glutamate dehydrogenase (gdh) and elongation factor 1a (eghf) Sequences of cat-isolates will be compared to the respective sequences of cattle isolates and of other trichomonad species. Prospectively, the introduction of species-specific DNA probes for the detection of amplification products should allow an even more refined genotyping by real-time PCR.
- Assessment of cytopathic effects in cell-culture. Bovine and feline genital epithelial cell cultures will be infected with cat and cattle isolates, respectively, and the effects will be assessed. Criteria: morphological changes, occurrence of apoptosis and/or necrosis as assessed by specific markers (Annexin-V labelling, Caspases, Trypanblue assay etc).
Research on T. foetus in cats is still in the beginning, with many important questions still unanswered. By collaborating in this dynamic field, the BVET and the IPB can make themselves internationally known as competence centres in this important research area.
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Projektziele
(Deutsch)
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Ziel des Projektes ist es, festzustellen ob es sich bei den bei Katzen gefundenen T. foetus Organismen um dieselbe Spezies handelt wie beim Rind. Im Gegensatz zu den Trichomonaden wurden bei Giardia lamblia, einem phylogenetisch relativ nahen verwandten Organismus, umfassende Genotypisierungen durchgeführt. Bei diesen Arbeiten wurden Gene identifiziert, welche sich zur Unterscheidung verschiedener Stämme anbieten, z.B. Gene für die Triose-Phosphat Isomerase (TPI) oder für die Glutamatdehydrogenase (GDH). Glücklicherweise existiert ein Genomprojekt für Trichomonas vaginalis, mit dessen Hilfe Kandidatengene mit konservierten Regionen (Stellen für Primer) und variablen Regionen (zur Unterscheidung der Spezies) zu identifizieren sein sollten. Verschiedene Trichomonaden-Spezies (z.B: T. foetus, T. suis, P. hominis, T. vaginalis; alle im Haus) werden mit den neuen PCRs analysiert und die jeweiligen Sequenzen mit den analogen Sequenzen der Katzenisolate verglichen. Diese Sequenzvergleiche werden Auskunft darüber geben, ob es sich bei den Tritrichomonaden der Katze um dieselbe Spezies handelt wie beim Rind. Selbstverständlich werden auch verschiedene T. foetus Referenzstämme (auch im Haus) mit denselben PCRs auf Sequenzunterschiede der Amplifikate innerhalb der Spezies T. foetus untersucht. Diese Analyse ist v.a. bei den Genomabschnitten wichtig, wo ein starker Polymorphismus erwartet wird.
Zudem soll ein InVitro System etabliert werden anhand dessen die Reaktion von bovinen epithelialen Zellen aus dem Geschlechtsapparat auf Infektionen mit verschiedenen Trichomonas spp. (insbesondere T. foetus aus dem Rind und aus der Katze) untersucht werden kann. Zwei Arbeiten von Singh et al. (1999 und 2004) haben zeigen können, dass Tritrichomonas foetus, nicht aber Trichomonas vaginalis, Apoptose hervorruft in bovinen vaginalen Epithelzellen. Diese Studien haben mit Primärkulturen gearbeitet, d.h. sie haben die Zellen direkt aus Vaginalbiopsien von weiblichen Rinderfoeten gewonnen. Kommerziell sind fast keine analogen Zelllinien erhältlich, und wenn, müssen sie zuerst auf Infektion mit BVDV getestet werden (dieses Virus würde die Apoptose hemmen). Deshalb müssen wir die Kulturen wohl zuerst etablieren. Erfahrung in dieser Technik ist an unserem Institut vorhanden (Etablierung einer primären epithelialen Zelllinie aus dem Hundeduodenum (Golaz & Vonlaufen et al.,2007)). Anstelle von Vaginalzellen könnten auch Endometriumzellen verwendet werden. Die Zellen werden mit T. foetus aus dem Rind und aus der Katze infiziert um zu analysieren, ob die zwei Isolate unterschiedliche Effekte auf die Zellen haben. Anschauen würden wir cytopathische Effekte und ein besonders Augenmerk werden wir auf apoptotische Vorgänge richten. Die Methoden dazu sind im Wesentlichen Mikroskopie, inkl. Immunfluoreszenz und biochemische Analysen (Annexin-V Labelling, Caspasen-Nachweis, Trypanblau-Assay u.a.).
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Umsetzung und Anwendungen
(Deutsch)
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Umsetzung:
- Erkenntnisgewinn Tritrichomonas foetus
- Grundlagenprojekt: neue Anhaltspunkte ob Katzen Reservoir von T. foetus
UMS 2011:
Die Erkenntnisse aus dieser Pilotstudie wurden umgesetzt im Rahmen der Planung eines Folgeprojekts (Feldstudie). Status: erledigt. (mvo) Auflagen: Projekt ist erledigt, wenn Publikation erschienen ist.
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Publikationen / Ergebnisse
(Englisch)
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Burgener, I.A.; Frey, C.F.; Kook, P.H.; Gottstein, B. (2009) Tritrichomonas fetus: Ein neuer Parasit im Darm von Schweizer Katzen. Schweiz.Arch.Tierheik. 151: 8, 383-389.
Frey, C.F.; Schild, M.; Hemphill, A.; Stünzi, P.; Müller, N.; Gottstein, B.; Burgener, I.A. (2009) Intestinal Tritrichomonas foetus infection in cats in Switzerland detected by in vitro cultivation and PCR. Parasitol Res 104, 783-788.
Reinmann, K.; Müller, N.; Kuhnert, P.; Campero, C.M.; Leitsch, D.; Hess, M.; Henning, K.; Fort, M.; Müller, J.; Gottstein, B.; Frey, C.C. (2011) Tritrichomonas fetus isolates from cats and cattle show minor genetic differences in unrelated loci ITS-2 and EF-1. Veterinary Parasitology
Frey, C.F.; Müller, N. (in press) Tritrichomonas e Systematics of an enigmatic genus. Molecular and Cellular Probes xxx 1-5.
Comparative analysis of Tritrichomonas foetus (Riedmuller, 1928) cat genotype,T. foetus (Riedmuller, 1928) cattle genotype and Tritrichomonas suis (Davaine,1875) at 10 DNA loci Jan Šlapeta a,⇑, Norbert Muller b, Colin M. Stack c, Giselle Walker d, Ala Lew-Tabor e, Jan Tachezy f,Caroline F. Frey
Zugehörige Dokumente
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