HUMAN(E) PYROGEN TEST: Comparison and validation of novel pyrogen tests based on the human fever reaction

• Forschungsstelle: EU FRP
• Projektnummer: 99.0580-2
• Projekttitel Englisch: HUMAN(E) PYROGEN TEST: Comparison and validation of novel pyrogen tests based on the human fever reaction

Schlüsselwörter (Englisch)

Endotoxin; cytokine; fever; monocytes

Alternative Projektnummern (Englisch)

EU project number: QLRT-1999-0081

Forschungsprogramme (Englisch)

EU-programme: 5. Frame Research Programme - 1.1.2 Control of infectious diseases

Kurzbeschreibung (Deutsch)

Siehe Abstract

Partner und Internationale Organisationen (Deutsch)

Coordinator: STZ InPuT, Konstanz (D)

Abstract (Deutsch)

Am 3. Meeting in Strassburg vom 14. - 16. Jan. 2001 wurde ein Methoden-Transfer-Plan beschlossen. Das Labor von Novartis sollte demnach die Methode des Veterinärvirologischen Instituts Bern (VVI, (THP-1 Zellen/TNFa) übernehmen und die eigene Methode (isolierte Monozyten/IL-6) an die Uni Konstanz und ans ECVAM in Ispra transferieren. Ausserhalb des Programms wurde die Novartis-Methode auch an die Uni Innsbruck und das National Institute for Biological Standards and Control in London (NIBSC) übergeben.
Eine Mitarbeiterin von Novartis war 3 Tage am VVI und wurde in die Methode inkl. Auswertung eingeführt. Der benötigte Zellstamm wurde nach Basel transferiert und die Methodik erfolgreich im eigenen Labor etabliert. Dabei wurden vorwiegend bakterielle Endotoxine im Sinne von Dosis-Wirkungskurven geprüft.
Je eine Mitarbeiterin bzw ein Mitarbeiter der Universitäten Konstanz und Innsbruck sowie des ECVAM in Ispra und des NIBSC in London haben während 3 -4 Tagen unser Labor in Basel besucht und sind in unsere Methode eingeführt worden. Die Besucher konnten eigene Experimente durchführen und direkt das Gelernte anwenden. Für weitere Experimente im jeweils eigenen Labor wurde den Besuchern die notwendigen speziellen Reagenzien abgegeben.
Des Weiteren wurde in Strassburg ein Prüfplan sowie Prüfmuster von zwei problematischen Produkten abgegeben. Es handelte sich um Humanes Serum Albumin (HSA) sowie Gentamicin zur Injektion. Die Prüfmuster sollten in verschiedenen Verdünnungen mit verschiedenen Mengen von Endotoxin bzw. Lipoteichonsäure (Pyrogen aus grampositiven Bakterien, Staphylokokken) kontaminiert und in der laboreigenen Methode geprüft werden.
In niedrigen Verdünnungen wie 1:5 oder 1:10 zeigt HSA eine Spike-Recovery zwischen 100 und 275% während bei höheren Verdünnungen eine deutliche Hemmung des Endotoxin-Nachweises beobachtet wurde. Die Ursachen für dieses Verhalten sind noch nicht geklärt. Andere Labors bestätigen diesen Trend. Der Nachweis der zugesetzten Lipoteichonsäure bot dagegen keine Schwierigkeiten. In Verdünnungen zwischen 1:50 und 1:5000 lag die Spike Recovery um 100%.
Die Injektionslösung von Gentamicin zeigte starke Hemmung des Endotoxins in den Prüfkonzentrationen von 4 und 2mg/ml. Bei 0.4mg/ml war keine Hemmung des Endotoxin-Nachweises mehr zu beobachten. Lipoteichonsäure zeigte in diesem Test ein ähnliches Verhalten wie Endotoxin.
Diese Resultate wurden am 4. Meeting in Varenna (30. 6. - 2. 7. 2001) präsentiert.
Die revidierte (definive) Fassung des Standard Operating Procedure (SOP) wurde erstellt. Die Theorien für ein geeignetes Prediction Model für die Anwendung in der pharmazeutischen Idustrie wurden als Draft abgegeben.
In Varenna wurden die Teilnehmer der Studie mit einem Validierungsprogramm beauftragt. In Phase A dieses Programms ist die laboreigene Methode auf verschiedene Parameter zu testen:
· Generelle Streuung innerhalb des Tests an 20 Wiederholungen
· Nachweisgrenze (gemessen am Internationalen Standard von Endotoxin)
· Variationsursache 'Tag' (gleicher Blutspender an 3 verschiedenen Tagen)
· Variationsursache 'Operator' (3 verschiedene Operatoren mit dem gleichen Blutspender)
· Variationsursache 'Blutspender' (8 verschiedene Blutspender am gleichen Tag)
Die Rohaten wurden zur Auswertung an den Statistiker in Konstanz geschickt.
Die Variationen innerhalb des Tests wurden als akzeptabel beurteilt. Die Nachweisgrenze ist im Vergleich zu andern Methoden sehr tief und liegt bei 0.063 EU/ml. Die Kovarianten 'Tag' und 'Operator' haben nur einen geringen Einfluss auf das Prüfergebnis. Der 'Blutspender' hingegen hat eine nicht unerhebliche Wirkung auf das Ergebnis. Durch ein geeignetes Auswertungsmodell und dank der Robustheit der Methode kann diese Problem jedoch gelöst werden.

Datenbankreferenzen (Englisch)

Swiss Database: Euro-DB of the
State Secretariat for Education and Research
Hallwylstrasse 4
CH-3003 Berne, Switzerland
Tel. [phone]
Swiss Project-Number: 99.0580-2