B-V Monooxygenases: Biotransformations using Baeyer-Villiger mono-oxygenases

• Forschungsstelle: EU FRP
• Projektnummer: 99.0526
• Projekttitel Englisch: B-V Monooxygenases: Biotransformations using Baeyer-Villiger mono-oxygenases

Schlüsselwörter (Deutsch)

Biotransformationen; Chirotechnologie

Alternative Projektnummern (Englisch)

EU project number: BIO4-CT98-0267

Forschungsprogramme (Englisch)

EU-programme: 4. Frame Research Programme - 4.1 Biotechnology

Kurzbeschreibung (Deutsch)

Siehe Abstract

Partner und Internationale Organisationen (Deutsch)

Coordinator: University College London (UK)

Abstract (Deutsch)

Die folgenden Hauptergebnisse in den 5 Teilprojekten wurden erzielt:

1.Ein stabiles Fermentations- und Aufarbeitungsverfahren für rekombinante Cyclohexanonmonooxygenase aus E.coli im
300L-Massstab wurde entwickelt und eine stabile Aufbewahrungsform als Ammoniumsulfat-Suspension gefunden.
Diese hat sich auch als beste Form für die weitere Reinigung und Kristallisation erwiesen.Die Aktivität der
Herstellungen beträgt 20 U/ml, was wesentlich besser als die bisherigen Herstellungen ist. Die Präparation ist zudem
frei von Lactonase-Fremdaktivität.
2.Weitere Verbesserungen konnten in der Fermentation und Aufarbeitung von Camphermonooxygenase aus Pseudomonas
putida, Cyclopentanonmonoxygenase aus Pseudomonas sp. und Cyclohexanonmonoxygenase aus Xanthobacter
autotrophicus erzielt werden.
3.Die Aufarbeitung von enzymatischen Baeyer-Villiger Transformationen im Pilotmassstab wurde mittels Adsorption,
Extraktion und Kieselgel-Chromatographie entwickelt und ergab die reinen Enantiomere
(1R,5S)-3-Oxabicyclo-[3.3.0]-oct-6-en-2-one mit >99% ee sowie (1S,5R)-2-Oxabicyclo-[3.3.0]-oct-3-one mit >99%
ee.
4.Die Entwicklung eines rationalen Ansatzes für die Selektion und Handhabung von Reaktoren für die
BVMO-Biokatalyse wurde mit der Erstellung einer Datenbank und eines Entscheidungsgerüsts auf zwei Pfeiler gestützt.
5.(5) Die Auffindung neuer Baeyer-Villiger-Monooxygenasen wurde durch die Entwicklung eines neuen Farbtests
erleichtert. Die Isolierung der BVMO aus Cunninghamella echinulata in zellfreier Form ist noch nicht gelungen, doch
wurden neue Erkenntnisse über die optimalen Fermentationsbedingungen für eine optimale Aktivität der BVMO in
ganzen Zellen von Cunninghamella echinulata gewonnen.Zudem wurden zwei neue Enzyme (ADH und Esterase) aus
Cunninghamella echinulata isoliert.
6.Die Biotransformation von Bicycloheptenon mit rekombinanter Cyclohexanonmono-oxygenase aus E.coli und
Kofaktor-Rezyklierung mittels Glucose-6-phosphatdehydrogenase wurde optimiert und die Trennung der beiden
isomeren Lactone erfolgreich durchgeführt. Um den Prozess zu vereinfachen, wurde CHMO auf Eupergit C
immobilisiert. Eine weitere Vereinfachung dieser Biotransformation ist durch den Einsatz ganzer Zellen von
Cunninghamella echinulata möglich, wobei gezeigt werden konnte, dass nur ein Enantiomer gebildet wird und die
Reinigung einfacher ist.
7.Die Synthese neuer Substrate wurde entwickelt, um die Toleranz der vorhandenen BVMO gegenüber weiteren
funktionellen Gruppen zu prüfen.

Zusammenfassend kann bilanziert werden, dass trotz der kurzen Laufzeit enorme Fortschritte in Richtung industrieller
Prozesse für Baeyer-Villiger-Biotransformationen erzielt worden sind. Es gilt nun in Zukunft, die oben erwähnten
Fortschritte bei Fluka sowie die von allen andern Projekt-Partnern erworbenen neuen Erkenntnisse nachhaltig in die Praxis
umzusetzen. Am Abschlussmeeting in Mailand wurde von den Projektpartnern beschlossen,dass Fluka dabei die
wissenschaftliche Leitung übernimmt.

Datenbankreferenzen (Englisch)

Swiss Database: Euro-DB of the
State Secretariat for Education and Research
Hallwylstrasse 4
CH-3003 Berne, Switzerland
Tel. [phone]
Swiss Project-Number: 99.0526