Schlüsselwörter
(Englisch)
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Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis - paratuberculosis - Crohn's disease - PCR-based detection
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Kurzbeschreibung
(Englisch)
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Mycobacterium (M.) avium subsp. paratuberculosis is the etiological agent of paratuberculosis, a chronic granulomatus enteritis in ruminants, also known as Johne's disease. This disease is responsible for major financial losses to the livestock industry worldwide. Although paratuberculosis is on the list of the notifiable diseases, the prevalence of this infection in Switzerland is not known. In recent years, attention and discussion have been devoted to the possible association of M. avium subsp. paratuberculosis and Crohn's disease. Crohn's disease is a chronic inflammatory bowel disease that primarily affects the ileum in humans and bears considerable similarity to the histopathology of cattle with Johne's disease.
One constraint on efforts to control the disease is the limitation in the sensitivity of currently available laboratory diagnostic techniques. The overall goal of this proposal is to develop and optimize a PCR method for the detection of the agent in food (meat, milk) and clinical material (e.g. feces, intestine, spleen). This research will provide a new tool for the quick, accurate and early identification of infected cattle, particularly those animals subclinically infected.
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Projektziele
(Englisch)
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- Development of a powerful M. avium subsp. paratuberculosis-DNA extraction method
- Development of a PCR assay for the direct detection of M. avium subsp. paratuberculosis in food (milk and meat products) and clinical specimen; comparison to culture methods;
- Checkout our PCR system by testing feces, meat, and milk derived from a risk population (emaciated cows which are slaughtered during a certain time period at the slaughterhouse in Basel, Switzerland) and fecal and clinical samples collected from diseased animals
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Abstract
(Deutsch)
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Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) ist der Erreger der Paratuberkulose, eine chronisch verlaufende Enteritis bei Wiederkäuern. Weltweit entstehen durch diese Krankheit bedeutende wirtschaftliche Verluste infolge von Milch- und Mastleistungsrückgang, chronischer Abmagerung, höherer Infektionsanfälligkeit und Todesfälle. Der Erreger wird über Kot, Milch und Colostrum ausgeschieden. Die Tiere infizieren sich in seltenen Fällen bereits intrauterin oder in den ersten Lebensmonaten (fäkal-oral), wobei die Inkubationszeit sehr lange dauert (einige Monate bis zu drei Jahren). Die Infektion verläuft meist inapparent, so dass ein infiziertes Trägertier schwer detektierbar ist. Therapieren ist nicht möglich. Die Kultivierung des Erregers ist sehr zeitaufwändig (12 - 18 Wochen) gilt jedoch immer noch als Goldstandard. Die Entwicklung einer zeitsparenden und präzisen Nachweismethode, wie Real-time PCR, ist vielversprechend und erlaubt eine Diagnose innerhalb kürzester Zeit.
Aufgrund des möglichen zoonotischen Potentials des Erregers gilt es, die Paratuberkulose-Prävalenz in der Schweiz zu bestimmen und die diesbezogene Lebensmittelsicherheit abzuklären (from stable to table), da die Tenazität des Erregers sehr hoch ist und MAP eine Pasteurisation überleben kann. Um Informationen bezüglich Vorkommen von MAP in Gewebe zu gewinnen, verwendeten wir ein Real-time PCR Nachweissystem, welches in unseren Laboratorien zum MAP Nachweis in Kotproben entwickelt wurde. Um verschiedene Methoden miteinander vergleichen zu können, wurde Gewebe (Lymphknoten, Muskel, Leber, Milz und Niere) mittels Real-time PCR, Kultur und Kryomikroskopie untersucht.
Lymphknoten (LN) und Muskel stammten von 100 abgemagerten Kühen (> 24 Monate) der Gruppe 1, von 34 Rinder (< 18 Monate) der Gruppe 2 (Proben der beiden Gruppen wurden in einem Schweizer Schlachthof behoben), und zwei klinisch infizierten Kühen (Gruppe 3). Leber, Milz und Niere wurden nur von Tieren der Gruppe 3 untersucht. LN und Muskel wurden mit zwei Gewebeaufschlussmethoden (Kryostat und Polytron), eingesetzt vor der eigentlichen DNA-Extraktion, analysiert und die Resultate miteinander verglichen. Unabhängig von der Gewebeaufschlussmethode wurden mittels Real-time PCR aus 134 LN 15 (11.2%) als positiv identifiziert, von denen 14 (10.4%) Kultur positiv ausfielen, 12 von Gruppe 1 und 2 von Gruppe 2. Bei der Gegenüberstellung der beiden Nachweisverfahren waren 99.2% der Resultate übereinstimmend mit einem Kappa-Wert von 96.1%. Die Sensitivität unseres Real-time PCR beträgt 100% und die Spezifität 99.2 %, sofern Kultur als Goldstandard betrachtet wird. In der Kryomikroskopie wurden aus den 134 LN 21 (15.7%) als säurefest identifiziert. Wurde die Kryomikroskopie mit der Kultur verglichen, so fielen 94.8% der Resultate übereinstimmend aus und der Kappa-Wert beträgt 77.1%, die Sensitivität 100% und die Spezifität 94.2%. MAP konnte auch in Muskel und bei klinisch infizierten Kühen in Leber, Milz und Niere mittels Real-time PCR, jedoch nicht kulturell, nachgewiesen werden. Die DNA-Extraktion aus Muskel mittels Polytron war sensitiver als mittels Kryostat. Die Paratuberkulose Prävalenzen variierten je nach angewandtem Test von 5.9% bis 8.8% bei Gruppe 2 und von 12% bis 19% bei Gruppe 1. Da unser Real-time PCR eine hohe Sensitivität und Spezifität aufweist, betrachten wir diese Methode als eine zeitsparende und präzise Nachweismethode, welche in einem Nationalen Überwachungsprogramm eingesetzt werden kann.
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Abstract
(Englisch)
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Two different diagnostic methods for the detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis, the etiological agent of Johne's Disease, were compared. Fecal samples were derived from 310 cows, representing 13 commercial dairy herds located in 8 cantons of Switzerland. Detection tests for Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis were culture (gold standard) and a newly designed Real-time PCR. Real-time PCR identified 31 of 310 animals (10%) as positive whereas culture identified 20 (6.5%) as positive. The observed agreement of the two tests was 91.3% and the Kappa-value was 42%. Our Real-time PCR had a sensitivity of 60% and a specificity of 93.4% when culture was used as the gold standard. Depending on the test used, the paratuberculosis prevalence in our tested risk population ranged from 6.5% to 10%. Since Real-time PCR and culture data were in good agreement, and furthermore, Real-time PCR generates data in a short time in contrast to culture we consider Real-time PCR as a reliable alternative method to culture for the detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in a national surveillance program.
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Publikationen / Ergebnisse
(Deutsch)
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Seitert, G. (2003) Entwicklung und Validierung molekularer Methoden für den Nachweis von Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in Gewebe von geschlachteten agemagerten Schweizer Kühen. 44. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft, Garmisch-Partenkirchen, Deutschland.
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Publikationen / Ergebnisse
(Englisch)
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Seitert, G., Bissig-Choisat, B., Kohler, C., Wittwer, M., Wassenaar, T. M., Jemmi, T., Frey, J., and K. Bögli-Stuber (2004) Development and Validation of molecular methods for the detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) in tissues from slaughtered emaciated Swiss cows. Submitted.
Bögli-Stuber, K., C. Kohler, G. Seitert, B. Glanemann, M. C. Antognoli, M. D. Salman, M. M. Wittenbrink, M. Wittwer, T. M. Wassenaar, T. Jemmi, and B. Bissig-Choisat (2003) Detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in Swiss Dairy Cattle by Real-time PCR, Culture and Serology. Submitted.
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