ARAbiom Phase 2 – Gen Monitoring als zusätzliches Diagnoseinstrument auf ARAs

• Forschungsstelle: BAFU
• Projektnummer: UTF 755.05.25

Schlüsselwörter (Deutsch)

Abwasserreinigungsanlage, Mikrobiom, biologische Reinigung, qPCR-Analyse, 16S-rRNA-Sequenzierung, funktionelle Gene, Nitritakkumulation, Prozessüberwachung

Kurzbeschreibung (Deutsch)

Die biologische Reinigung einer Abwasserreinigungsanlage (ARA) ist ein technisches Ökosystem zur Entfernung von Schadstoffen im Abwasser, das unter anderem aus einer komplexen mikrobiellen Gemeinschaft besteht. Eine gut funktionierende und etablierte mikrobielle Gemeinschaft in der biologischen Reinigung ist essenziell für die stabile Prozessleistung einer ARA. Das Mikrobiom der biologischen Reinigung unterliegt jedoch einem ständigen Wandel, der auf die Dynamik der Abwasserzusammensetzung, die mikrobielle Konkurrenz, saisonal wechselnde Umweltparameter und den Betrieb der biologischen Reinigung zurückzuführen ist. Die induzierten Veränderungen in der mikrobiellen Gemeinschaft führen nicht zwangsläufig zu Prozessstörungen oder Leistungseinbrüchen. Wenn jedoch die Grundstabilität des Mikrobioms gestört ist, d. h. eine essenzielle, funktionelle Gilde fehlt, oder nicht die erwartete Leistung erbringt, kann sich dies negativ auf die gesamte Gemeinschaft auswirken. Dies kann zu Prozessstörungen wie z.B. Nitritakkumulation, Schwimmschlamm oder N2O-Emissionen führen und längere Phasen mit unzureichender Anlagenleistung bewirken.

In einem Vorgängerprojekt (UTF 711.31.22) wurde ein Mikrobiom-Monitoring-System basierend auf DNA-Analysen, der 16S-rRNA-Sequenzierung, zur Identifikation und Klassifikation von Bakterien für ARAs entwickelt. Mithilfe dieser Analyseresultate können die Anlagenbetreiber die biologischen Prozesse überwachen und optimieren. Dies ermöglicht es ihnen, Betriebsmittelkosten zu senken und die Reinheit des aus der ARA abgeleiteten gereinigten Wassers zu verbessern, wodurch letztendlich die Gewässerqualität geschützt wird. Die gewählte 16S-Methodik (16S-rRNA-Sequenzierung) liefert ein gutes Gesamtbild der Zusammensetzung und der Veränderung des Mikrobioms. Bei der Analyse der Dynamik bestimmter funktioneller Bakteriengruppen sind jedoch die Unsicherheiten der 16S-Methodik zu gross, um Massnahmen für den Betrieb ableiten zu können. In diesem Folgeprojekt sollen nun quantitative qPCR-Analysen zur gezielten Quantifizierung spezifischer, funktioneller Gene gemacht werden. Diese Methode ist sehr sensitiv und kann geringe Mengen der Ziel-Gene in komplexen Umweltproben nachweisen, was besonders wichtig für die Erkennung von Veränderungen in der Genmenge ist. 

Ergebnisse gemäss Vertrag (Deutsch)

1. Die Assays für die Identifikation der funktioneller Gene amoA (für AOBs) und nxrA (für NOB) wurden entwickelt. Die bestehenden Proben aus dem Vorgängerprojekt wurden ausgewählt und analysiert. Die Daten wurden mit jenen der 16S-Methodik verglichen. Meilenstein 1
2. Zusätzliche Analysen wurden auf der ARA Langmatt mit dem Fokus der Optimierung des Hybridwirbelsystems und des Wachstums von Comammox-Bakterien gemacht. Meilenstein 2
3.  An der ARA EAWAG wurden Versuche zur Reduktion von Phasen mit Nitritakkumulation und erhöhter Lachgasproduktion gemacht. Die bestehende Technologie der qPCR kann in das bestehende Angebot von upwater implementiert werden. Meilenstein 3
4.  Ein Schlussbericht mit Darstellung der Ergebnisse aus 1 bis 3 und dem weiteren Vorgehen ist redigiert und dem BAFU abgegeben. Der Bericht gibt zudem Auskunft zur erfolgten Zielgruppenansprache (zukünftige Nutzer der Innovation), den Massnahmen zur Markteinführung und zu den erwarteten Entwicklungen bis in 5 Jahren.

Projektziele (Deutsch)

Das Ziel des Projektes ist es, mittels qPCR-Analysen eine frühzeitige Detektion von Veränderungen in den funktionellen Genabundanzen von Ammonium-oxidierenden Bakterien (AOBs) und Nitrit-oxidierenden Bakterien (NOBs) in Belebtschlamm, welche im Zusammenhang mit Nitritakkumulationen und potenziellen Lachgasüberschreitungen stehen, zu ermöglichen. Somit sollen die qPCR-Analysen die 16S-rRNA-Sequenzierung ergänzen und zusammen ein umfassendes Bild der mikrobiellen Gemeinschaften und ihrer Dynamik liefern, mit dem Ziel die biologischen Prozesse auf ARAs besser zu kontrollieren.

Beschreibung der Resultate (Deutsch)

Im Rahmen der Machbarkeitsstudie «GenARA» wurden die geplanten technischen Projektziele erfolgreich erreicht. Es konnten robuste und reproduzierbare qPCR-Assays für die funktionellen Schlüsselgene amoA (Ammonium-oxidierende Bakterien, AOB) und nxrB (Nitrit-oxidierende Bakterien, NOB) entwickelt, optimiert und validiert werden. Die Verwendung synthetischer DNA-Standards (g-blocks) erwies sich dabei als besonders effizient und ermöglichte eine schnelle und standardisierte Assay-Entwicklung.

Die entwickelten qPCR-Methoden wurden anhand von Praxisproben verschiedener Schweizer Abwasserreinigungsanlagen (ARA REAL, GVRZ und ARA Langmatt) validiert. Dabei zeigte sich eine hohe Übereinstimmung zwischen den qPCR-Daten und den bereits etablierten 16S-rRNA-Sequenzierungsdaten. Die qPCR konnte insbesondere die Dynamik von Nitrospira-Populationen sowie Veränderungen der AOB-Populationen zuverlässig nachvollziehen. Gleichzeitig wurde deutlich, dass aufgrund der hohen Spezifität der verwendeten Primer bestimmte funktionelle Gruppen, wie beispielsweise Nitrotoga, nicht erfasst werden und zusätzliche Primer erforderlich wären, um die gesamte funktionelle Diversität der Nitrifikanten abzubilden.

Die wichtigste Erkenntnis der Studie ist die erfolgreiche methodische Kreuzvalidierung der bestehenden 16S-rRNA-Analytik. Die Ergebnisse belegen, dass die von upwater etablierte Mikrobiomanalyse auch bei funktionell relevanten Organismengruppen mit geringer Abundanz robuste und belastbare Resultate liefert. Patentanmeldungen wurden im Rahmen des Projektes nicht eingereicht.

Umsetzung und Anwendungen (Deutsch)

Die entwickelte qPCR-Methodik konnte erfolgreich in die bestehende Laborinfrastruktur der upwater AG integriert und unter Praxisbedingungen validiert werden. Die Ergebnisse zeigten jedoch, dass die qPCR-basierte Quantifizierung funktioneller Gene im Routinebetrieb keinen ausreichenden verfahrenstechnischen Mehrwert gegenüber, der bereits etablierten 16S-rRNA-Sequenzierung bietet. Insbesondere erfordert die vollständige Erfassung funktioneller Bakteriengruppen eine Vielzahl spezifischer Primer-Systeme, wodurch der laboranalytische Aufwand deutlich ansteigt.

Aus wirtschaftlichen und technischen Gründen wird die qPCR-Analyse deshalb nicht als eigenständiger kommerzieller Zusatzservice in das Produktportfolio aufgenommen. Die Resultate des Projekts konnten jedoch direkt zur methodischen Absicherung und Validierung der bestehenden 16S-rRNA-Dienstleistungen genutzt werden und stärken damit nachhaltig die wissenschaftliche Grundlage des bestehenden Monitoringsystems der upwater AG.

Weiteres Vorgehen (Deutsch)

Die im Projekt aufgebaute qPCR-Infrastruktur sowie das erworbene methodische Know-how bilden eine wertvolle Grundlage für zukünftige Entwicklungen im Bereich des mikrobiellen Prozessmonitorings auf Abwasserreinigungsanlagen. Ein besonderes Potenzial wird dabei in der RNA-basierten Aktivitätsmessung mittels Reverse-Transcriptase-qPCR (RT-qPCR) gesehen. Im Gegensatz zur DNA-basierten Analyse ermöglicht die RT-qPCR die direkte Erfassung der biologischen Aktivität funktioneller Mikroorganismen und könnte dadurch eine frühzeitigere Erkennung von Prozessstörungen ermöglichen.

Für eine zukünftige Umsetzung sind jedoch weitere Forschungs- und Entwicklungsarbeiten erforderlich, insbesondere hinsichtlich Probenstabilisierung, RNA-Extraktion und Validierung geeigneter Aktivitätsmarker. Parallel dazu werden die im Projekt gewonnenen Erkenntnisse zur weiteren Optimierung und wissenschaftlichen Weiterentwicklung der bestehenden 16S-rRNA-basierten Monitoringplattform genutzt.