ToViPoRe: massive detection of tomato brown rugose fruit virus by high-throughput sequencing

• Forschungsstelle: BLW
• Projektnummer: 22.25

Schlüsselwörter (Deutsch)

Jordan-Virus, Tomate, Paprika, molekulares Nachweisverfahren, Next Generation Sequencing

Schlüsselwörter (Englisch)

Jordan-virus, tomato, capsicum, molecular detection method, next generation sequencing

Schlüsselwörter (Französisch)

Jordan-virus, tomate, poivron, méthode de détection moléculaire, next generation sequencing

Schlüsselwörter (Italienisch)

Jordan-virus, pomodoro, capsico, metodo di rilevamento molecolare, next generation sequencing

Kurzbeschreibung (Deutsch)

Laut den Gesuchstellern bildet das Tomato Brown Rugose Fruit Virus (ToBRFV) ist eine ernsthafte Bedrohung für den Schweizer Tomaten- und Paprikaanbau. Das RNA-Virus ist wegen seines grossen Schadpotenzials seit Januar 2020 als «potentieller Quarantäneorganismus» geregelt und unterliegt der Melde- und Bekämpfungspflicht. Im 2021 kam es in der Schweiz zum ersten Schadensfall. Im 2022 wurden mehrere Verdachtsproben bei importierten Setzlingen positiv getestet. Aufgrund des grossen Risikos fordern die Tomatenproduzenten die Möglichkeit eines Massentests. Nur der rasche und eindeutige Nachweis des Virus kann die Verbreitung über befallene Setzlinge verhindern.

Das ToViPoRe-Projekt zielt auf zwei Nachweisstrategien ab: 1) die Entwicklung eines spezifischen LAMP Assays für den raschen und kostengünstigen Nachweis von ToBRFV und 2) die Entwicklung einer isothermalen Amplifikationsmethode gekoppelt an die Hochdurchsatz-Sequenziertechnologie mittels Nanoporen. Letztere ermöglicht nicht nur den eindeutigen Nachweis von ToBRFV oder naher verwandten Tobamoviren, sondern auch das parallele Analysieren einer grossen Anzahl Proben. Ein zuverlässiges Diagnosetool für ToBRFV ist unerlässlich. Dafür arbeiten die Antragssteller mit verschiedenen Akteuren aus der Forschung, Branche (VSGP) und dem Vollzug eng zusammen.

Das vorliegende Projekt visiert technologisches Neuland in der Pflanzenkrankheits- und Schädlingsdiagnostik an. Ist das Proof-of-Concept erfolgreich, wird die künftige Diagnostik stark davon profitieren können.

Kurzbeschreibung (Englisch)

The virus disease epidemic caused by the Tomato Brown Rugose Fruit Virus (ToBRFV) is a serious threat for Swiss tomato and pepper growers. Despite being classified as a “potential quarantine organism” since early 2020, this RNA virus was identified in Switzerland in 2021 on imported plants. Multiple interceptions on imported seedlings already occurred in 2022. Swiss tomato growers are now requesting for an intensification of ToBRFV diagnostics during the planting season to minimize the risk. With an ever-increasing number of samples, the sample-to-answer time must remain as low as possible.
The ToViPoRe project aims at two detection strategies: 1) the development of a fast, cheap and specific YES/NO LAMP assay to ease the diagnostics of ToBRFV and 2) the combination of nucleic acid isothermal amplification with high-throughput sequencing using nanopores to provide an even more accurate diagnostic tool for ToBRFV as well as other tobamoviruses species in many samples simultaneously. The need for a reliable mass testing diagnostic tool for ToBRFV and other related tobamoviruses is evi-dent. To this end, the applicants work closely with various stakeholders from research, industry (VSGP) and enforcement.
This project aims at breaking new technological ground in plant pathogen and pest diagnostics. Future diagnostics will benefit greatly from this project which constitutes a proof of concept.

Abstract (Deutsch)

Ziel des ToViPoRe-Projekts war die Entwicklung schneller, kostengünstiger und skalierbarer Diagno-seinstrumente für das Tomato Brown Rugose Fruit Virus (ToBRFV) und andere Tobamoviren. Durch den Einsatz von isothermalen Amplifikationsmethoden und Nanoporen-Sequenzierung wurde ein flexib-les Nachweisverfahren entwickelt. Das ToViPoRe-Tool kann an verschiedene Erreger angepasst wer-den. Es ermöglicht eine Echtzeit-Datenanalyse und die Sequenzierung langer DNA-Abschnitte. Zudem hat es das Potential für Felddiagnostik. Die LAMP-Assays erwiesen sich trotz geringerer Sensitivität im Vergleich zur RT-qPCR als nützlich für den Nachweis von ToBRFV. RT-RPA und RT-PCR in Kombina-tion mit Nanoporen-Sequenzierung ermöglichen die Art- und Variantenbestimmung. Die Methodenvali-dierung zeigte vielversprechende Resultate, trotz einiger Einschränkungen. Mit der Integration der Nano-poren-Sequenzierung in die Agrodiagnostik können mehrere Krankheitserreger frühzeitig erkannt und gezielte Managementmassnahmen eingeleitet werden. Dadurch kann die Ausbreitung gefährlicher Erre-ger verhindert werden. Die Zusammenarbeit und transparente Kommunikation unter den Projektpartnern waren entscheidend für den Erfolg des Projekts und ebnen den Weg für zukünftige Fortschritte in der Pflanzengesundheitsdiagnostik.

Abstract (Englisch)

The ToViPoRe project aimed to develop rapid, cost-effective, and scalable diagnostic tools for the To-mato Brown Rugose Fruit Virus (ToBRFV) and other tobamoviruses. Utilizing isothermal amplification methods and nanopore sequencing, the project successfully created a flexible detection workflow. The ToViPoRe tool, adaptable to various pests, offers real-time data analysis, long-read capabilities, and field-based diagnostics. Despite lower sensitivity compared to RT-qPCR, the LAMP assays proved use-ful for ToBRFV diagnostics. The project also explored RT-RPA and RT-PCR methods, enhancing spe-cies and variant determination when coupled to nanopore sequencing. Validation showed promising re-sults, though some limitations were noted. The project's outcomes support the integration of nanopore sequencing for agrodiagnostics, enabling early detection of pathogens and targeted management measures, ultimately preventing the spread of dangerous pests. Collaborative efforts and transparent communication among partners were key to the project's success, paving the way for future advance-ments in plant health diagnostics.