Effekte von Pflanzenschutzmitteln auf das Transkriptionsmuster bei Bienen

• Forschungsstelle: BLW
• Projektnummer: 16.27

Schlüsselwörter (Deutsch)

Honigbienen, Bienengesundheit, Pflanzenschutzmittel, Neonicotinoide, Bio-Marker, Transkriptionsmuster

Schlüsselwörter (Englisch)

Honey bees, bee health, pesticides, neonicotinoids, bio-markers, transcription patterns

Schlüsselwörter (Französisch)

Abeilles, santé des abeilles, pesticides, néonicotinoïdes, biomarqueurs, schémas de transcription

Kurzbeschreibung (Deutsch)

Die Bienengesundheit beschäftigt die Bevölkerung, die Politik und die Landwirtschaft in grossem Ausmass. Sie wird aktuell im Nationalen Massnahmenplan für die Gesundheit der Bienen und im Aktionsplan zur Risikoreduktion und nachhaltigen Anwendung von Pflanzenschutzmitteln (PSM) spezifisch angesprochen. Viel diskutiert wird die Relevanz des Einsatzes von PSM für die Bienengesundheit. Insbesondere werden einige häufig untersuchte sehr bienentoxische und systemisch wirkende Neonicotinoide mit dem Bienensterben in Verbindung gebracht. Viel weniger ist über die Wirkung anderer im konventionellen und im Biolandbau oft verwendete PSM hinsichtlich unerwünschter, subletaler Wirkungen auf Bienen bekannt. Ziel dieses Projektes ist es, entsprechende Forschungs- und Monitoringdaten zu generieren und die Etablierung molekularer Biomarker für die chronische Toxizität bei Bestäubern voran zu treiben. Solche molekularen Biomarker, verwendet als Indikatoren für unerwünschte toxikologische Wirkungen in Nichtzielorganismen, könnten die erforderlichen Prüfanforderungen für die Zulassung neuer PSM nicht nur stark vereinfachen, sondern auch verbessern und effektiver machen. Weiter wird die Kenntnis der Effekte von PSM auf die Genexpression und Translation in Nichtzielorganismen helfen, die zellulären Wirkmechanismen, welche der Beeinträchtigung der Bienengesundheit zu Grunde liegen, besser zu verstehen. Mit diesem Wissen können neue Pflanzenschutzstrategien mit möglichst geringen Auswirkungen auf Nützlinge erarbeitet werden. Damit liefert dieses Projekt einen Beitrag zur nachhaltigen Intensivierung der Landwirtschaft.

Projektziele (Deutsch)

Das Forschungsprojekt hat damit folgende spezifische Ziele (involvierte Institutionen in Klammern):

1. (FHNW): Weiterentwicklung von Biomarkern für die Evaluation von PSM. Zusätzlich zu den bereits identifizierten Biomarkern sollen neue evaluiert werden, die aufgrund des Wirkmechanismus des PSM identifiziert werden sollen. Darunter sind Gene, die auf das Immunsystem der Bienen und auf die neuronale Aktivität im Gehirn zielen. Zudem soll die physiologische Wirkung auf das Immunsystem mittels Bestimmung von Blutzellen in der Hämolymphe analysiert werden. Schliesslich sollen auch drei Enzym-Assays (Acetylcholin Esterase Assay, Glutathion-S-Transferase-Assay, Katalase-Assay) etabliert werden, mit denen physiologische Wirkungen (vor allem bei Organophosphaten) erfasst werden können.
2. (FHNW und Agroscope): Analyse eines Neonicotinoids auf das gesamte induzierte Transkriptionsmuster mittels RNAseq. Basierend darauf sollen weitere Biomarker identifiziert und mit qPCR validiert werden. Um die Liste potentiellen Biomarker für biologische Effekte bei der Honigbiene zu erweitern, soll die RNAseq-Technik angewandt werden. Ziel dabei ist es, die gesamte Reaktion des Transkriptoms nach Exposition an ein ausgewähltes Neonicotinoids und die involvierten biologischen Pathways zu beschreiben, also die gesamte Reaktion des PSM auf das Expressionsmuster zu erfassen. Damit sollen weitere aussagekräftige Biomarker identifiziert werden, welche Wirkungen von PSM auf Bienen anzeigen und die in der Zulassung von PSM von Bedeutung sein könnten.
3. (FHNW): Evaluation von in der Landwirtschaft häufig verwendeter PSM in Laborstudien in ihrer Wirkung auf Honigbienen mittels qPCR. Die Analyse soll PSM mit verschiedenem Wirkungsmechanismus beinhalten, insbesondere auch Organophosphate. Subletale molekulare Wirkungen werden mittels Biomarkern in Dosis-Wirkungs-Beziehungen erfasst. Ziel ist es zu ermitteln, ob und welche Genantworten diese PSM zeigen. PSM mit verschiedenem Wirkungsmechanismus sollen verglichen werden um ihre Gefahren zu evaluieren. Weiteres Ziel ist es, die Grundlagen für die ausgedehntere RNAseq-Analyse zu setzten (Ermittlung von Dosis-Wirkungsbeziehungen und zeitliche Dynamik).
4. (FHNW und Agroscope). Analyse von drei wichtigen PSM auf das globale Transcriptionsmuster mittels RNAseq. Aufgrund der Evaluation der PSM mittels qPCR sollen wichtige PSM auf ihr globales Expressionsmuster untersucht werden. Dabei soll die Gesamtheit der Gentranskript-Änderungen erfasst und daraus Biomarker identifiziert werden. Die aus der RNAseq-Analyses resultierenden wichtigsten Gentranskripte werden mittels qPCR validiert.

Abstract (Deutsch)

Die Forschungsergebnisse erlauben eine bessere Charakterisierung der Wirkung von Pflanzenschutzmitteln (PSM), gerade im Hinblick auf ihre chronische Wirkung, und könnten dadurch eine Verbesserung im Zulassungsverfahren ermöglichen. Zudem lassen sie Aussagen zur Nachhaltigkeit verschiedener Wirkstoffe hinsichtlich ihrer Toxizität auf Bestäuber zu. Diese fliessen einerseits in die Priorisierung der Massnahmen im Rahmen der Umsetzung des Aktionsplans PSM ein, andererseits können sie als Grundlage für die Weiterentwicklung des PSM-Einsatzes in einer nachhaltigen Landwirtschaft dienen.

Arbeitsvorgang/Stand der Arbeiten (Deutsch)

1. Meilenstein: Entwicklung von neuen Biomarkern in Honigbienen mittels qPCR

Neue Biomarker für Immunsystem-relevante Gene werden etabliert und die Analyse von Hämocyten optimiert. Zudem sollen die Enzym-Assays etabliert werden, die vor allem in der Wirkungsanalyse von Organophosphaten wichtig sind.

2. Meilenstein: Expositionsversuche von adulten Bienen mit PSM

Bienen werden an sechs verschiedene PSM mit verschiedenen Wirkungsmechanismen exponiert und Dosis-Wirkungs-Beziehungen ermittelt. Adulte Arbeiterinnen werden oral über Zuckersirup an die ausgewählten PSM für 24, 48 und 72 h exponiert gefolgt von der Analyse der Genexpression der oben aufgeführten Gene.

3. Meilenstein: Entwicklung von RNAseq in Honigbienen und Validierung von Transkripten

Basierend auf den Ergebnissen der qPCR-Versuche (Gewebe, Zeitpunkt, Dosis), wird als erstes das globale Transkriptionsmuster von Neonicotinoiden (Thiamethoxam, Acetamiprid) in zwei Dosen zu einem Expositionszeitpunkt bestimmt. Die Exposition erfolgt an der FHNW, RNAseq am FGCZ und die bioinformatische Datananalyse und –darstellung bei Agroscope. Die in der RNAseq wichtigsten 5-6 identifizierten Gene werden mittels qPCR valdiert.

Die moderne Next-Generation-Sequenzierung produziert enorme Mengen an Daten. Um diese rasch wachsenden Datenmengen effizient und mit optimierter Qualität analysieren zu können, werden mit hoher Frequenz neue, verbesserte Softwareprogramme bzw. -Module entwickelt. Die in diesem Projekt produzierten Daten werden in der Agroscope-Forschungsgruppe „Molekulare Diagnostik, Genomik und Bioinformatik“ mit neuesten, validierten Programm-Modulen in eigens dafür optimierten Analyse-Pipelines verarbeitet. Dies garantiert, dass die Daten mit den aktuell besten Tools ausgewertet werden.  

4. Meilenstein: Analyse von zwei PSM mittels RNAseq und Validierung von Transkripten

Ausgehend von den Resultaten in den Meilensteinen 2 und 3 werden die globalen Transkriptionsmuster eines Organophosphats und eines Phyrethroids bestimmt. Das Vorgehen soll wie in Meilenstein 3 mit erforderlichen Anpassungen erfolgen. Dabei sollen auch Biomarker identifiziert und mittels qPCR quantifiziert werden.

 

Resultate

Hier wurden die Wirkungen der Neonicotinoide Acetamiprid, Clothianidin, Imidacloprid und Thiamethoxam als Einzelverbindungen und als binäre Mischungen bei Honigbienen untersucht. Es wurden transkriptionelle Änderungen von nAChR Untereinheiten und Vitellogenin im Gehirn von experimentell exponierten Honigbienen nach Exposition bis zu 72 h bestimmt. Die Expositionskonzentrationen wurden auf der Grundlage der niedrigsten Wirkkonzentrationen der einzelnen Verbindungen ausgewählt. Die transkriptionelle Induktion von nAChRs und Vitellogenin war bei Thiamethoxam am stärksten und bei Acetamiprid am schwächsten. Die binären Mischungen zeigten weitgehend keine additiven Transkriptionsinduktionen, aber sie waren weniger als additiv. Unsere Daten deuten darauf hin, dass die gemeinsame transkriptionelle Aktivität von Neonicotinoide nicht durch Konzentrationsaddition erklärt werden kann. Die in vivo-Effekte werden nicht allein durch agonistische Interaktion mit nAChRs beherrscht, sondern sind abhängig von komplexeren Interaktionen mit anderen Pathways. Es sind weitere Studien erforderlich, welche die physiologischen Gelenkeffekte von Mischungen aus Neonicotinoide und andere Pflanzenschutzmittel auf Bienen untersuchen, um die gemeinsame Wirkung besser zu verstehen.