Entwicklung und Validierung von diagnostischen Methoden für M. bovis und M. agalactiae

• Forschungsstelle: BLV
• Projektnummer: 1.98.02

Schlüsselwörter (Deutsch)

Bakteriologie, Diagnostik, PCR, Agalactie, Mycobacterien, Rind, Schaf, Ziege, Mycoplasma bovis, Mycoplasma agalactiae, Epidemiologie, Schweiz

Kurzbeschreibung (Deutsch)

Das vorliegende Forschungs- und Entwicklungsprojekt hat zum Hauptziel das Erarbeiten einer hochsensiblen, genetischen Methode zum Nachweis von M. bovis und M. agalactiae aus klinischem Material durch nested PCR Methoden. Nach der Entwicklung und der grundlegenden Prüfung der Sensitivität und Spezifität dieser PCR Methoden ist es vorgesehen, diese Methoden durch parallele serologische, bakteriologische Studien von M. bovis und M. agalactiae infizierten und freien Tierbeständen zu validieren. Nebst der Validierung der serologischen Methode ist vorgesehen, die präliminären Grundlagen für eine zukünftige, erweiterte Studie für die Serologie relevanten Antigene zu erarbeiten.

Projektziele (Deutsch)

Entwicklung einer hochsensiblen nested PCR Methode zum Nachweis von M. bovis und M. agalactiae

Abstract (Deutsch)

Teil 1
Mycoplasma bovis ist verantwortlich für eine Reihe von Krankheitsbildern beim Rind. Die Infektion verläuft bei Kälbern als Atemwegserkrankung und ein Teil der betroffenen Individuen entwickelt im Rahmen einer septikämisch verlaufenden Krankheit zudem Arthritiden. Die Mykoplasmen-Infektion der Atemwege prädisponiert betroffene Individuen zudem für Sekundärinfekte mit verschiedenen opportunistischen Erregern von Luftwegserkrankungen. Bei adulten Rindern führt M. bovis zu schweren, hochkontagiösen Mastitiden sowie zu sporadischen Fällen von Arthritis und Aborten. Wegen der Präsenz des Erregers in der schweizerischen Rinderpopulation und den damit verbundenen wirtschaftlichen Schäden ist ein Monitoring der epidemiologischen Situation unerlässlich. Der Erregernachweis im Labor ist für eine definitive Diagnose nach wie vor nötig, für eine weiträumige Überwachung und epidemiologische Studien aber zu teuer und schwerfällig. Das Ziel des Projektes war daher die Entwicklung und Validierung serologischer und molekularer Methoden für den Nachweis einer Infektion mit M. bovis.
Für die molekulare Identifikation von M. bovis (und M. agalactiae) aus Mykoplasmenkulturen oder klinischem Material wurde eine PCR entwickelt. Die Methode basiert auf der Amplifikation eines konservierten Fragments aus dem uvrC-Gen der Mykoplasmen. Das uvrC-Gen ist in allen Isolaten vorhanden und variabel genug um eine sichere Speziesdiagnose zu stellen. Im Rahmen einer Dissertationsarbeit wurde gezeigt, dass diese PCR geeignet ist, um M. bovis direkt aus klinischen Proben nachzuweisen. Für dieses Projekt stand ein neu entwickelter ELISA-Test für den Nachweis von Antikörpern gegen M. bovis zur Verfügung und konnte in inter-nationaler Zusammenarbeit validiert werden. Im Rahmen einer Dissertationsarbeit wurde damit die Seroprä-valenz von M. bovis in Milchvieh-Beständen im Kanton Jura untersucht, ebenso die möglichen Risikofaktoren für M. bovis-Infektionen. Diese Daten wurden ergänzt durch eine landesweite Untersuchung der Seroprävalenz.
Mittels der neuen Verfahren konnte gezeigt werden, dass M. bovis in der schweizerischen Rinderpopulation en-demisch ist. Die Seroprävalenz bei adulten Tieren ist relativ hoch, aber die Erregerausbreitung ist in diesem Kollektiv offenbar nicht sehr aktiv. Tierverkehr scheint für die Ausbreitung von M. bovis eine erhebliche Rolle zu spielen. Für Kälber liegen erst wenige Daten vor, aber es gibt eine Reihe von Hinweisen dafür, dass die Ver-breitung von M. bovis vor allem in dieser Altersgruppe aktiv ist. Da die Infektion zu erheblichen wirtschaftlichen Einbussen führt, ist eine weitere Untersuchung dieses Kollektivs angezeigt. Die dank dieser Arbeit zur Verfügung stehenden diagnostischen Verfahren, erlauben eine systematische epidemiologische Studie.

Teil 2
Zur eindeutigen Identifikation von M. agalactiae und M. bovis wurde eine auf dem uvrC Gen basierende PCR-Methode entwickelt. Diese Methode wurde validiert und ist zur Zeit die offizielle genetische Methode zur Identifikation von M. agalactiae und M. bovis. Die PCR-Methode für M. agalactiae wird im Jahr 2004 in das OIE-Manual, Kapitel über kontagiöse Agalaktie, aufgenommen. Die genetische Forschungen ergaben neue Erkenntnisse über molekulare Mechanismen und die Antigenizität von M. agalactiae sowie über die genetische Plastizität und Evolution von M. agalactiae und M. bovis. Insbesondere wurde bei M. agalactiae ein Cytadhäsin identifiziert, welches bei der Adhäsion von M. agalactiae an Schafs-Epitelzellen eine zentrale Rolle spielt. In M. agalactiae und M. bovis wurden neue Insertionssequenzen entdeckt, welche für die Evolution von M. agalactiae und M. bovis sowie für die Subtypisierung von Stämmen beider Spezies sehr wertvoll sind.
In einer schweizerischen Studie wurde die Rolle von M. bovis bei respiratorischen Infekten in der Kälbermast untersucht. Bei M. bovis-seropositiven Tieren war die Gewichtszunahme deutlich geringer, und der Bedarf an therapeutischen Antibiotika um 172 % höher als bei M. bovis-negativen Kälbern.

Publikationen / Ergebnisse (Deutsch)

Vogel, G. (1999): Kälberpneumonien - Aktualisierung des bakteriellen Erregerspektrums und der Resistenzlage gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen. Dissertation, Vet.-Med. Fakultät, Bern. 

Tschopp R. (2001) Epidemiologische Studie der Risikofaktoren bei Mycoplasma bovis-Infektionen der Mastkälber. Diss. Universität Bern.

Publikationen / Ergebnisse (Englisch)

Fleury, B., Bergonier, D., Berthelot, X., Schlatter, Y., Frey, J., Vilei, E.M. (1998): Charcterization and Analysis of a Stable Serotype-Associated Membrane Protein (P30) of Mycoplasma agalactiae. Journal of Clinical Microbiology, Aug. 2001, 2814-2822.

Vogel, G. (1999): Kälberpneumonien - Aktualisierung des bakteriellen Erregerspektrums und der Resistenzlage gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen. Dissertation, Vet.-Med. Fakultät, Bern.

Burnens, A. P., Bonnemain, P., Bruderer, U., Schalch, L., Audigé, L., Le Grand, D., Poumarat, F. et Nicolet, J. (1999): Etude sur la séroprévalence de Mycoplasma bovis chez la vache laitière en Suisse, en particulier dans la République et Canton du Jura. Schweiz. Arch. Tierheilk. 141, 455-460.

Bonnemain, P. (1998): Etude sur la séroprévalence de Mycoplasma bovis chez la vache laitière dans la République et Canton du Jura. Dissertation, Vet.-Med. Fakultät, Bern.

Subramaniam, S., Bergonier, D., Poumarat, F., Capaul, S., Schlatter, Y., Nicolet, J. and Frey, J. (1998): Species identification of Mycoplasma bovis and Mycoplasma agalactiae based on the uvrC genes by PCR. Mol Cell. Probes 12, 161-169.

Fleury, B., Bergonier, D., Berthelot, X., Schlatter, Y., Frey, J., Vilei, E.M. (1998): Charcterization and Analysis of a Stable Serotype-Associated Membrane Protein (P30) of Mycoplasma agalactiae. Journal of Clinical Microbiology, Aug. 2001, 2814-2822.

Subramaniam, S., Bergonier, D., Poumarat, F., Capaul, S., Schlatter, Y., Nicolet, J. and Frey, J. (1998): Species identification of Mycoplasma bovis and Mycoplasma agalactiae based on the uvrC genes by PCR. Mol Cell. Probes 12, 161-169.

Hotzel, H., Frey, J., Bashiruddin, J. and Sachse, K. (2002) Detection and Differentiation of Ruminant Mycoplasmas. In: Methods in Molecular Biology Volume 216: PCR Detection of Microbial Pathogens. K. Sachse & J. Frey (Eds). Humana Press Totowa, New Jersey. pp 231 - 245.

Frey, J. (2002): Mycoplasmas of Animals. Molecular Biology and Pathogenicity of Mycoplasmas, Chapter 4. Razin and Herrmann (Eds). Chapter 4, pp. 73-90. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York.

Pilo, P., Fleury, B., Marenda, M., Frey, J. and Vilei, E.M. (2003) Prevalence and distribution of the insertion element ISMag1 in Mycoplasma agalactiae. Vet. Microbiol. 92:37-48.

Fleury, B., Bergonier, D., Berthelot, X., Peterhans, E., Frey, J. and Vilei, E.M. (2002) Characterization of P40, a cytadhesin of Mycoplasma agalactiae. Infect. Immun. 70:5612-5621.

Bashiruddin J.B., Frey J., Heldtander-Königssohn M., Johansson K.-E., Hotzel H., Diller R., de Santis P., Regalla J., Botelho A., Ayling R., Nicholas R.A.J., Thiaucourt F. and Sachse K. (1993) Evaluation of PCR systems for the identification and differentiation of Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma bovis: a collaborative trial. Research in Veterinary Science, submitted.

Thomas A., Linden A., Mainil J., Dizier I., Baseman J.B., Kannan T.R., Fleury B., Frey J. and Vilei E.M. (2003) The p40* adhesin pseudogene: implications for understanding the evolution of Mycoplasma bovis. Infection and Immunity, submitted.

Tschopp R., Bonnemain P., Nicolet J. and Burnens A. (2001) Epidemiologische Studie der Risikofaktoren für Mycoplasma bovis-Infektionen bei Mastkälbern. Schweiz. Arch. Tierheilk. 143: 461-467.

Publikationen / Ergebnisse (Französisch)

Burnens, A. P., Bonnemain, P., Bruderer, U., Schalch, L., Audigé, L., Le Grand, D., Poumarat, F. et Nicolet, J. (1999): Etude sur la séroprévalence de Mycoplasma bovis chez la vache laitière en Suisse, en particulier dans la République et Canton du Jura. Schweiz. Arch. Tierheilk. 141, 455-460.

Bonnemain, P. (1998): Etude sur la séroprévalence de Mycoplasma bovis chez la vache laitière dans la République et Canton du Jura. Dissertation, Vet.-Med. Fakultät, Bern.