Schlüsselwörter
(Deutsch)
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Maul- und Klauenseuche-Virus, ELISA, rekombinantes Antigen, Serotyp-Differenzierung, VP1,
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Schlüsselwörter
(Englisch)
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foot-and-mouth disease virus, antibody detection, ELISA, recombinant antigen, VP1, structural proteins, serotype differentiation,
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Kurzbeschreibung
(Deutsch)
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Die Maul- und Klauenseuche (MKS) stellt nach wie vor auch für Europa und damit die Schweiz eine grosse Bedrohung für den Nutztierbestand dar. Wie schnell sich die Situation dramatisch ändern kann, wird anhand der gegenwärtigen MKS-Epidemie in England und weiteren EU-Staaten in aller Deutlichkeit sichtbar.
Ein zentrales Element bei der Bekämpfung und der Prophylaxe der MKS stellt eine rasche, zuverlässige und sensitive Labordiagnostik dar. Während ein Virusnachweis primär dann durchgeführt wird, wenn es darum geht, in einem klinischen Verdachtsfall MKS auszuschliessen, ist ein Nachweis von Antikörper gegen das MKS-Virus (MKSV) bei verschiedenen Fragestellungen erforderlich, wie zum Beispiel bei Monitoring Untersuchungen zum Nachweis der MKS-Freiheit oder anlässlich von Tierimporten.
Während in den letzten Jahren für den Virusnachweis dank der Molekularbiolgie verschiedene moderne Me-thoden entwickelt wurden, werden MKSV-Antikörper mit konventionellen virologischen Methoden, primär mittels Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISAs), Serumneutralisationstests, oder Komplementbindungsreaktion nachgewiesen.
In den letzten Jahren wurden grosse internationale Anstrengungen unternommen, den gegenwärtig eingesetzten sogenannten Liquid Phase Blocking ELISA (LPB-ELSA), der vom Internationalen Tierseuchenamt als Standard-Methode akzeptiert ist, zu vereinheitlichen und zu verbessern. Trotzdem ist es bis heute nicht gelungen, den Test zu standardisieren, und regelmässig durchgeführte Ringtests des WHO/OIE Referenzlabors für MKS in Pirbright UK zeigen bis heute unbefriedigende Ergebnisse. Zudem ist der LPB-ELISA im Vergleich mit anderen ELISAs sehr zeit- und arbeitsaufwändig. Ueberdies bedingt die Herstellung der notwendigen Reagentien (Antigene, Detektionsantikörper) den Umgang mit infektiösem MKSV sowie den Einsatz von Labortieren zur Antiserumproduktion.
Von verschiedenen Labors wurden in den letzten Jahren Anstrengungen unternommen, mittels gentechnisch hergestellten Antigenen ELISAs zu entwickeln, die zwischen geimpften und infizierten Tieren unterscheiden können. Bis heute ist aber keiner dieser Tests, die auf der Verwendung von Nichtstruktur-Proteinen als Anti-gene beruhen, zur Praxistauglichkeit entwickelt worden. Das Hauptproblem dabei ist die zu geringe Spezifität.
Aus diesem Grund haben wir uns vor einigen Jahren entschlossen, eine andere Strategie zur Entwicklung eines neuartigen ELISAs einzuschlagen, nämlich unter Verwendung von rekombinant hergestelltem VP1 (=Hauptimmunogen des MKSV) Antigen einen indirekten ELISA zum MKSV-Antikörpernachweis zu entwik-keln. Ein solcher Test kann immer dann eingesetzt werden, wenn nur zwischen Antikörper-positiv und -negativ unterschieden werden muss, was gegenwärtig in Europa der Fall ist, da keine Imfung erlaubt ist und jedes serologisch positive Tier als MKSV-infiziert gilt.
Aufgrund von früheren erfolgreich in unserer Forschungsgruppe entwickelten ELISAs (Klassische Schweinepest, Porcines Reproduktives und Respiratorisches Syndrom) waren wir überzeugt, dass die gleiche Strategie auch für die Entwicklung eines MKS-ELISAs gebraucht werden kann. Leider sind im Verlaufe dieses Projektes (Dissertation Monique Wenger) zahlreiche unerwartete Schwierigkeiten aufgetreten (unspezifische Reaktion von Probeseren gegen die als Fusionsproteine exprimierten Antigene, mangelndes Serotyp-Differenzierungsvermögen u.a.m.), so dass wir trotz einer Projektverlängerung das gesteckte Ziel noch nicht erreicht haben. Immerhin werden wir bis zum Abschluss des laufenden Projektes einen ELISA zur Verfügung haben, der zumindest den Nachweis von MKSV Serotyp O Antikörpern erlaubt, allerdings nicht als indirekter, sondern als Blocking ELISA.
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Kurzbeschreibung
(Englisch)
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Detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus (FMDV) is usually done by serum neutralisation test, complement fixation, or liquid phase blocking ELISA using complete virus particles as antigen.
In order to avoid the use of infectious FMDV for antibody detection, we recently started to develop a novel ELISA based on the use of recombinant VP1 expressed as a fusion protein (BVET project number 1.98.07). Unfortunately, despite of the use of different fusion partners for VP1, none of these antigens was suitable as antigen in an indirect ELISA, due to unspecific reactions of the sera with the fusion partners.
In the present project, we propose to modify the strategy for developing an ELISA as follows: (i) VP1 from FMDV serotype Asia 1 will be included in order to broaden the range of serotype detection; (ii) serotype-specific anti-VP1 monoclonal antibodies will be made to allow the establishment of a blocking ELISA; and (iii) truncated VP1 proteins will be expressed to allow a more specific serotype differentiation of anti-FMDV anti-bodies.
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Projektziele
(Deutsch)
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Das hier beschriebene Projekt, das sich als Fortsetzungsprojekt aufdrängt, um den ELISA zur Praxisreife zu entwickeln, beinhaltet folgende Hauptziele:
(i) Durch Verkleinerung (Truncation) der rekombinanten VP1 soll die Serotyp-Spezifität der Antigen-Antikörper- Reaktion erhöht werden.
(ii) Entsprechende Antigene, wie wir sie bis heute für die Serotypen O und A zur Verfügung haben, sollen auch für Asia 1 hergestellt werden (auf die Expression von Serotyp C Antigenen wird verzichtet, da dieser Serotyp weltweit in den letzten Jahren nie mehr bei MKS-Ausbrüchen isoliert wurde, somit als "ausgestorben" angesehen werden kann). Die während der Arbeit von M. Wenger gemachten Erfahrungen werden dazu dienen, die beste Alternative der verschiedenen Möglichkeiten von Fusionspartnern für die Proteinexpression zu wählen.
(iii) Damit der ELISA tierartunabhängig eingesetzt werden kann, sollen in Zusammenarbeit mit der Gruppe Immunologie am IVI Hybridomas zur Produktion von Serotypspezifischen monoklonalen Antikörpern gegen A und Asia 1 generiert werden. Diese sollen dann analog zum gegenwärtig für den Serotyp O entwickelten Blocking ELISA eingesetzt werden.
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Projektziele
(Englisch)
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The results obtained so far provide the basis for further test development, aiming at three main areas of mo-difications:
(i) Generation of mAbs against recombinant VP1 from FMDV serotypes A, O, C, and - in a later phase Asia1. These mAbs will be characterized in terms of their potential to be used as indicator antibody in an SPB-ELISA to detect any FMDV antibodies, and, if they prove to react with serotype-specific epitopes (conformational or sequential), for the differentiation of FMDV antibodies in sera from different animal species.
(ii) Further development of the indirect ELISA using VP1 cleaved off from its fusion partner. This requires the evaluation of additional/alternative protein purification procedures. Once VP1 can be obtained in a highly pure form, antigens from the three serotyps will be tested for their potential to allow serotype antibody differentiation, based on different reactivities when each of the homologous antigens is compared with the two respective heterologous forms. If a too high degree of cross-reactivity should occur, truncated forms of VP1 will be ex-pressed lacking parts of the protein known to contain epitopes common to all FMDV serotypes. However, since very limited information is available only as far as epitope mapping on VP1 is concerned (most of the published data refer to the mapping of epitopes for neutralizing mAbs only), a shotgun approach is also con-sidered, i.e. short VP1-specific peptides will be expressed and assessed for their suitability as serotype-specific antigens.
(iii) Based on the results obtained from parts (i) and (ii), an optimized system will be used to express authentic or truncated VP1 from FMDV serotype Asia 1 which will then be added to the three already available antigens to widen the spectrum of FMDV antibody detection and differentiation.
The ultimate goal will be the availability of a fully validated, highly sensititive and specific ELISA, which allows detection as well as serotype differentiation of antibodies against FMDV serotypes A, O, C, and Asia 1 on a single ELISA plate.
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Abstract
(Deutsch)
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Es gelang, VP1 der MKSV Serotypen A5 Allier, O PanAsia, and Asia 1 Shamir in für den Einsatz im ELISA ausreichenden Mengen zu exprimieren, während VP1 von zwei weiteren Virusstämmen (O1 Manisa, A Iran99) zwar ebenfalls exprimiert werden konnten, jedoch nicht in für die Testentwicklung ausreichender Quantität. Aus diesem Grund wurde der ELISA nur mit den ersteren drei Antigenen weiterentwickelt. Es zeigte sich, dass der ELISA im indirekten Testformat fähig ist, MKSV-Antikörper nachzuweisen und auch zu differenzieren, wobei sich aber grosse Unterschiede sowohl bezüglich Sensitivität als auch Spezifität zeigten in Abhängigkeit von den verwendeten Antigenen und ebenfalls von der Tierspezies der zur Validierung verwendeten Antiseren.
Somit steht nach Abschluss dieses Projektes ein indirekter ELISA zur Verfügung, der zwar grundsätzlich für die Routinediagnostik einsetzbar ist, jedoch noch nicht unseren Erwartungen genügt. Es ist deshalb geplant, den Test (i) weiter zu optimieren, (ii) mittels weiterer VP1-Antigene anderer MKSV-Serotypen auszubauen, und (iii) in einem alternativen Format (Mischen der verschiedenen Antigene) als Screening-Test für die An-/Abwesenheit von MKSV-Antikörpern (d.h. ohne Serotyp-Differenzierung) zu etablieren.
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Publikationen / Ergebnisse
(Deutsch)
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Zugehörige Dokumente
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Publikationen / Ergebnisse
(Englisch)
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Werner Brunhart. Development of a novel ELISA for the serotype-specific detection and differentiation of
foot-and-mouth disease virus antibodies using recombinant VP1 antigen. Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der VetSuisse-Fakultät der Universität Bern. 2004.
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