Entwicklung und Validierung von molekularen Diagnostikmethoden Detektion und Identifikation des Wurzelgallennematoden Meloidogyne enterolobii, einem neuen EPPO A2 Quarantänesschädling

• Forschungsstelle: BLW
• Projektnummer: 11.30

Schlüsselwörter (Deutsch)

Wurzelgallennematode Meloidogyne enterolobii, chinesischer Fadenwurm, Schädling, Detektion, Identifikation, Diagnostikmethoden, Ringtest

Schlüsselwörter (Englisch)

Meloidogyne enterolobii, Chinese nematode, pest, detection, identification, diagnostic methods, proficiency test

Schlüsselwörter (Französisch)

Meloidogyne enterolobii, nématode chinois, ravageur, détection, identification, méthodes de diagnostic, test de compétence

Kurzbeschreibung (Deutsch)

Aufgrund einer Einschätzung der European Plant Protection Organization (EPPO) wird der erwähnte Wurzelgallennematode – in der Schweiz auch als „chinesischer Fadenwurm“ bekannt – als Quarantänenematode empfohlen. M. enterolobii weist ein breites Wirtspflanzenspektrum sowie ein grosses Schad- und Vermehrungspotenzial auf. Insbesondere kann er offenbar alle zurzeit bekannten Resistenzen gegen tropische Wurzelgallennematoden umgehen. Um eine weitere Einschleppung und Verbreitung zu verhindern, sollen schnelle und akkurate Methoden zur Detektion und Identifikation entwickelt und validiert werden.
Im vorliegenden Projekt ist daher vorgesehen, den Ende 2011 erscheinenden EPPO Diagnostikstandard mit den neuesten molekularen Methoden zur Detektion und Identifikation von M. enterolobii zu ergänzen. Dieser Diagnostikstandard stellt den nationalen Pflanzenschutzorganisationen (NPPO) Basisinformationen zur Verfügung, jedoch nicht die neuesten Verfahren. Das Projekt wird im Rahmen des ERA-Nets EUPHRESCO zusammen mit weiteren europäischen Partnern durchgeführt, und sieht „Single Tube Assays“ sowie Ringtests als Training für unerfahrenes Laborpersonal vor. Das Projekt hat somit das Ziel, die diagnostische Expertise der NPPO in Europa zu verbessern.

Zugehörige Dokumente

• Projektbeschreibung [PDF] 523 kB

Methoden (Deutsch)

Entwicklung von Methoden zur Detektion von M. enterolobii in Boden oder Pflanzenmaterial:
- Aktive Nematodenstadien werden aus Boden und Pflanzenproben mit Standardmethoden extrahiert und anschliessend die gesamte DNA der Probe extrahiert.
- Verschiedene DNA-Extraktionskits (z.B. DNeasy, MoBio etc) werden auf ihre Eignung hin untersucht Nematoden DNA direkt aus Boden und Pflanzenmaterial zu extrahieren

Entwicklung und Validierung molekularer Methoden zur Detektion und Identifikation von M. enterolobii
- Verschiedene Assays (z.B. Taqman MGB, SYBR Green I, Roche Universal LNA) werden getestet, und die zwei besten Assays werden anschliessend auf zwei verschiedenen Plattformen und mit verschiedener Chemie getestet und optimiert
- Die Überprüfung der Sensitivität erfolgt mit DNA von 10 verschiedenen M. enterolobii Populationen
- Die Überprüfung der Spezifität erfolgt mit je zwei Referenzpopulationen von mindestens 6 anderen, zum Teil nah verwandten Meloidogynearten
- Mit dem optimierten Protocol werden DNA Extraktion und Detektion mit künstlich inokuliertem Boden und Pflanzenmaterial überprüft

Durchführung von Ringtests zur Detektion und Identifikation von M. enterolobii in Boden und Pflanzenproben.
- Die Proben bestehen aus Böden mit und ohne M. enterolobii in verschiedenen Dichten sowie befallenem und nematodenfreien Pflanzenmaterial
- Suspensionen werden mit Mischungen von Nematoden mit und ohne M. enterolobii sowie reine und gemischte Template-DNA verschickt, um alle Standards und neue Verfahren zu überprüfen und validieren

Projektziele (Deutsch)

Teilziel 1:
Detektion und Identifikation optimaler Weise als „Single Tube Assays“ entwickeln, die den Material und Zeitbedarf minimieren bei gleichzeitig hoher Spezifität und geringer Gefahr durch Kreuzkontaminationen.

Teilziel 2:
- Molekulare Diagnostikmethoden standardisieren und validieren
- Methoden zu Detektion von M. enterolobii in Boden und Pflanzenmaterial sollen eine hohe Sensitivität, Spezifität und Reproduzierbarkeit aufweisen

Teilziel 3:
Die Eignung aller vorhandenen und neu entwickelten Methoden für neue EPPO Diagnostikstandards untersuchen und eventuell nötige Anpassungen vornehmen.

Teilziel 4:
Die Ergebnisse der Ringtests vermitteln und Hands on Training ermöglichen um Wissenslücken zu füllen und zukünftige Forschungsfragen zu definieren.

Teilziel 5:
Eine weitere Einschleppung nach Europa und damit auch in der Schweiz unterbinden und dazu eine weitere Verbreitung zu verhindern.

Arbeitsvorgang/Stand der Arbeiten (Englisch)

 Work plan:

1. Test performance study on nematode extraction methods to detect motile stages (second stage juveniles) of M. enterolobii in soil samples.

2. Test performance study on fast and simple DNA extraction from target nematode in complex nematode suspension after extraction from soil samples (Lysis buffer; Holterman et al., 2009). DNA needs to be clean enough (without inhibitors) for further by molecular detection/identification tools. Labs were encouraged but not required to use additional extraction methods. The aim was to test a fast and simple DNA extraction protocol that can be harmonized between NPPO laboratories in the future.

3. Methods development and in-house validation of qPCR methods to detect, identify and potentially quantify M. enterolobii in complex nematode suspensions obtained from soil samples (develop protocols for robust, specific and sensitive detection/identification that can be harmonized between NPPO labs, independent of lab equipment and chemistry).

4. Test performance study on protocols developed under topic 3.

5. Final meeting to communicate and discuss results. Optional workshop on Barcoding as new diagnostic tool for fast and reliable nematode identification was offered to interested groups.

6. Publication of results in peer-reviewed research journals and discussion for inclusion of protocols into EPPO diagnostic standard protocol. Identification of future research priorities in the field of Meloidogyne enterolobii research.

Publikationen / Ergebnisse (Englisch)

Zugehörige Dokumente

• Final report EUPHRESCO II 2015 [PDF] 1'207 kB