Überprüfung eines neuen Testes zum selektiven Nachweis des kontagiösen Mastitiserregers Staphylococcus aureus Genotyp B in Betriebstankmilch – eine Feldstudie.

• Forschungsstelle: BLV
• Projektnummer: 1.11.09
• Projekttitel Englisch: Evaluation of a novel assay to detect Staphylococcus aureus Genotype B in bulk tank milk – a field study.

Schlüsselwörter (Deutsch)

S. aureus, Subtypen, Mastitis, Proben der Milchleistungsprüfung, Betriebstankmilch, PCR

Schlüsselwörter (Englisch)

S. aureus, subtypes, mastitis, milk samples of breeding programs, bulk tank milk, PCR

Kurzbeschreibung (Deutsch)

Staphylococcus aureus (S. aureus) ist einer der wichtigsten Mastitiserreger und bewirkt hohe wirtschaftliche Kosten. S. aureus verursacht hauptsächlich chronisch subklinische Mastitiden, welche nur eine geringe Heilungsrate aufweisen. In der konventionellen Bakteriologie bestehen Schwierigkeiten im Nachweis von S. aureus. Daneben spielt der Zeitpunkt der Probenentnahme eine wichtige Rolle, da der Erreger oft intermittierend ausgeschieden wird. Die diagnostische Sensitivität für S. aureus mittels bakteriologischer Kultur ist gering und die Identifizierung dieses Erregers oft nicht eindeutig, so dass wir eine entsprechende molekularbiologische Diagnostik entwickelt haben, die hoch spezifisch ist und in klinischen Milchproben eine bis 2000-fach höhere Empfindlichkeit aufweist als die konventionelle Bakteriologie (Graber et al., 2007; Studer et al., 2008).
In vorangegangenen Studien konnten wir zudem verschiedene Genotypen von S. aureus beschreiben, die sich hinsichtlich ihrer klinischen Eigenschaften wesentlich unterscheiden (Fournier et al., 2008; Graber et al., 2009). So verursacht S. aureus Genotyp B (GTB) kontagiöse subklinische Mastitiden mit Kuhprävalenzen, die bis zu 87% betragen können. Dies steht in einem klaren Gegensatz zu den anderen Genotypen (u.a. Genotyp C), welche sich auf Infektionen bei einzelnen Kühen beschränken.
Die bisherigen Studien basieren auf Einzelvierteluntersuchungen und aseptischer Probeentnahme. Zur Bekämpfung und die Überwachung ganzer Herden wäre aber eine Analytik äusserst vorteilhaft, die auf Betriebstankmilch (BTM) oder Milchproben der Milchleistungsprüfung (MLP-Proben) beruht. Wir haben daher eine entsprechende Methodik entwickelt und sie in-vitro evaluiert (Boss et al., 2010). Sie basiert auf der realtime quantitativen PCR (qPCR), ist hoch spezifisch für S. aureus GTB und erlaubt in Sammelproben, 1 GTBpositive Kuh unter 138 Kühen zu detektieren. Um ihre Praxistauglichkeit zu untersuchen, soll im vorliegenden Projekt eine prospektive Feldstudie durchgeführt werden. Insbesondere soll die diagnostische Sensitivität und Spezifität der Analytik bestimmt werden. Zu diesem Zweck werden BTM- und MLP-Proben von 35 GTB-positiven und 25 GTB-negativen Herden gesammelt und mit der neuen Analytik untersucht. Diese Untersuchungen erlauben zudem abzuklären, ob sich die MLP-Proben für die Herdenüberwachung bezüglich S. aureus GTB eignen. Zusätzlich wird die somatische Zellzahl in den Milchproben bestimmt, um eine entsprechende Korrelation zu den S.aureus GTB infizierten Eutern zu überprüfen. Schliesslich soll die Herdenprävalenz von S. aureus GTB repräsentativ für die Schweiz geschätzt werden.
Basierend auf der neuen qPCR-Analytik und unter Verwendung von BTM- oder MLP-Proben ist eine effiziente, kostengünstige und erfolgreiche Bekämpfung von S. aureus GTB auf Herdenebene und schweizweit zu erwarten. Zudem ist davon auszugehen, dass die Minimierung dieses Erregers in Schweizer Milchviehherden die Mastitis-bedingten Kosten in der Schweiz massiv senken wird.

Kurzbeschreibung (Englisch)

Staphylococcus aureus (S. aureus) is the most common cause of contagious mastitis in cattle and causes significant economic damage worldwide. Diagnosis of S. aureus by bacteriological testing of quarter milk samples is not satisfactory as the sensitivity is inadequate and the specificity is limited. As a consequence, we developed a novel molecular biological assay which is highly specific and which is 500 to 2000 times more sensitive in clinical milk samples than conventional bacteriology. In addition we were able to demonstrate by genotyping that there were various udder-associated subtypes whereby 1 subtype (genotype B, GTB) was particularly problematic as it was pathogenic and was associated with high infection rates (up to 87% of cows of a herd were infected). So far, our investigations were based on single-quarter milk samples taken under aseptic conditions. For control and monitoring whole herds, however, analytics based on bulk tank milk (BTM) samples would be most efficient and most economic. As a consequence, we propose a field study to evaluate our novel BTM analytics specific for S. aureus GTB and to investigate the herd prevalence of this subtype in Switzerland. The analytics includes our patented method of preparing bacteria from milk together with 3 real-time quantitative PCRs (qPCRs) for the detection of a GTB-typical point mutation within the lukE gene and for recognizing the sea and sed genes.
Based on our BTM qPCR analytics, an efficient and successful control of S. aureus GTB mastitis is expected. Minimization of this agent in dairy herds would massively reduce the high financial losses caused by bovine mastitis in Switzerland.

Projektziele (Deutsch)

Wie die obige kurze Zusammenfassung der Forschungsresultate zeigt, gab es wesentliche Neuerungen auf dem Gebiet der bovinen Mastitisdiagnostik und zu S. aureus, die das Potential haben, mittelfristig die Mastitis bedingten Kosten in der schweizerischen Land- und Milchwirtschaft wesentlich zu senken.
Chronische subklinische Mastitiden verursacht durch S. aureus Genotyp B, führen aufgrund der Therapieresistenz und der Gefahr der Übertragung von Kuh zu Kuh durch den Melkakt, zu grossen wirtschaftlichen Verlusten. Folgende Fragestellungen sollen in Rahmen des vorliegenden Antrages bearbeitet werden:

• In einer Feldstudie soll die diagnostische Sensitivität und Spezifität der neuen Analytik evaluiert werden, also die Wahrscheinlichkeit, dass eine tatsächlich GTB-positive Herde mit dem Test richtig erkannt bzw., dass eine tatsächlich GTB-negative Herde richtig ausgeschlossen wird (OIE). Erst in Kenntnis dieser Daten kann ein späteres Testergebnis interpretiert und eine Aussage zur entsprechenden Herde gemacht werden.
• Die Prävalenz der GTB-positiven Kühe in der Schweiz soll auf Herdenebene bestimmt werden: dadurch soll das Resultat auf Herdenebene bestätigt werden.
• Es soll untersucht werden, ob die MLP-Proben, die durch die Milchleistungsprüfer erhoben werden, sich zum Nachweis von S.aureus GTB eignen. Dies wäre eine grosse logistische Vereinfachung der Probenerhebung und damit eine wesentliche Voraussetzung, zukünftig die Bekämpfung und Überwachung von S. aureus GTB auf Herdenebene und schweizweit anzugehen.
• Durch die Bestimmung der somatischen Zellzahl (SCC) soll die Ausprägung der durch S. aureus GTB verursachten Mastitis untersucht werden.
• In einem zweiten Teil des Projektes soll die Herdenprävalenz von S. aureus GTB repräsentativ für die Schweiz geschätzt werden.
• Das Projekt ist als eine Machbarkeitsstudie dafür anzusehen, ob sich BTM- und/oder MLP-Proben zusammen mit molekularbiologischer Analytik grundsätzlich eignen, um rasch einen schweizweiten Überblick über Keime zu erhalten, die von seuchenpolizeilicher Relevanz (u.a. Salmonella spp., Brucella spp.) sind oder die für die Lebensmittelsicherheit eine wichtige Rolle spielen (u.a. Listeria monocytogenes, EHEC).
Das vorliegende Projekt ist Teil der Roadmap „Mastitis“, wie sie durch ALP, BVET, SMP, Suisselab, TSM
und die Wiederkäuerklinik der Universität Bern erarbeitet worden ist.

Umsetzung und Anwendungen (Deutsch)

UMS 2011:
Das Projekt hat Verspätung. Status: Kommt an UMS 2011.
(mvo)

UMS 2012:
Die Herdenprävalenzstudie wird noch in der ALP gemacht: Studie ist noch am Laufen. Zur Information: am 4. Dezember 2012 findet eine KT-Fachtagung zum Thema Milch statt, an der die Mastitisprojekte durch Martin Reist (Sanisys) vorgestellt werden: Projekt ist Teil der Road Map Mastitis mit den 3 Pfeilern: Forschung, Beratung, Überwachung/Kontrollen. Status: Kommt an UMS 2013. (mvo)

Publikationen / Ergebnisse (Englisch)

Mastitis diagnostics: Quantitative PCR for Staphylococcus aureus genotype B in bulk tank milk

R. Boss ,* J. Naskova ,† A. Steiner ,* and H. U. Graber *1* Clinic for Ruminants, Department of Clinical Veterinary Medicine, Vetsuisse-Faculty, University of Berne, 3001 Switzerland† Agroscope Liebefeld-Posieux Research Station ALP, 3003 Berne, Switzerland

* Clinic for Ruminants, Department of Clinical Veterinary Medicine, Vetsuisse-Faculty, University of Berne, 3001 Switzerland† Agroscope Liebefeld-Posieux Research Station ALP, 3003 Berne, Switzerland

Bovine mastitis: The diagnostic properties of a PCR-based assay to monitorthe Staphylococcus aureus genotype B status of a herd, using bulk tank milk C. Syring ,*1 R. Boss ,†1 M. Reist ,‡ M. Bodmer ,* J. Hummerjohann ,† P. Gehrig ,§ and H. U. Graber †2*
 
Clinic for Ruminants, Department of Clinical Veterinary Medicine, Vetsuisse-Faculty, University of Berne, 3012 Berne, Switzerland† Agroscope Liebefeld-Posieux Research Station ALP, 3003 Berne, Switzerland‡ Veterinary Public Health Institute, University of Berne, 3097 Liebefeld, Switzerland§ Suisselab AG Zollikofen, 3052 Zollikofen, Switzerland

* Clinic for Ruminants, Department of Clinical Veterinary Medicine, Vetsuisse-Faculty, University of Berne, 3012 Berne, Switzerland† Agroscope Liebefeld-Posieux Research Station ALP, 3003 Berne, Switzerland‡ Veterinary Public Health Institute, University of Berne, 3097 Liebefeld, Switzerland§ Suisselab AG Zollikofen, 3052 Zollikofen, Switzerland

Zugehörige Dokumente

• 1.11.09,_1.12.10_Datenblatt_MJB_2014,_Graber.pdf [PDF] 137 kB

URL-Adressen (Deutsch)

1.11.09 Graber Überprüfung eines neuen Testes zum selektiven Nachweis des kontagiösen Mastitiserreg…