1. Projektstufe (Teile davon wurden schon im September durch eine Post Doktorandin in Bellinzona und einer Doktorandin aus einem anderen Projekt am IVI begonnen)
Epidemiologische Abklärungen im Ufficio Veterinaria Cantonale in Bellinzona:
- Epidemiologische Abklärungen bei den seropositiven Betrieben der CAE-Stichprobe 2008 im Tessin: Altersstruktur und Rasse der Tiere, Haltungsbedingungen, Management, Impfungen, weitere Betriebscharakteristika, Import. Ziel ist, aufgrund dieser Daten möglichen Infektionsquellen und Übertragungswege zu eruieren wie z.B. kontaminierte Impfstoffe, andere Tierarten, Rolle von Culicoides, Importe etc.
- Deskriptive Auswertung dieser Daten in Zusammenarbeit mit dem Bereich Monitoring BVET.
Epidemiologische Abklärungen am IVI zusammen mit BVET:
- Epidemiologische Abklärungen bei den seropositiven Betrieben der CAE-Stichprobe 2008 in der Nordschweiz, in gleicher Art wie im Tessin, siehe oben.
Diagnostische Abklärungen am Istituto Cantonale di Microbiologia (ICMB):
- Abklärung, ob andere Wiederkäuerspezies in den betroffenen Betrieben im Tessin auch seropositiv sind. NB: Es sind erst wenige Tiere im Tessin gegen das BTV-8 geimpft, weil sich die Ziegen und Schafe bis in den Spätherbst auf den Alpen befunden haben. Eine serologische und virologische Untersuchung vor der Impfung ist also teilweise noch möglich. Für die Serologie wird der VMRD-ELISA verwendet, für den Virusnachweis kommt die PanBTV rRT-PCR-IVI zum Einsatz. In einer ersten Phase ist vorgesehen 20 Betriebe mit je 20 Proben zu testen.
- Seropositive Rinder- und Schafproben sowie alle viruspositiven Proben aus dem Tessin, werden ans IVI weiter geleitet, um Bestätigungstests durchzuführen und um zu versuchen, das Virusgenom (mindestens gewisse Genom-Segmente wie VP2) zu sequenzieren und das Virus selbst in Zellkulturen anzuzüchten.
- Gesammelte Culicoides aus den Jahren 2005-2007 (Projekt Racloz) werden mit der rRT-PCR-IVI analysiert, blutvolle und blutleere Gnitzen wenn möglich getrennt voneinander. Wird TOV gefunden, kann mit Sicherheit gesagt werden, dass das Virus schon zu der Zeit der Culicoides-Sammlung zirkuliert hat. Werden blutleere Culicoides positiv getestet, muss zudem davon ausgegangen werden, dass diese Gnitzen als Überträger des TOV fungieren können.
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Diagnostische Abklärungen am IVI:
- Serologisch positive und fragliche Proben der CAE-Stichprobe vom Tessin sollen mittels rRT-PCR-IVI stichprobenartig auf BTV-Genom untersucht werden. Falls virale RNA in genügender Menge nachgewiesen werden kann, soll dieses sequenziert werden, um den Beweis von zirkulierendem TOV zu erbringen.
- Neu im Herbst 2008 durch das ICMB im Tessin entdeckte seropositive Rinder- und Schafproben, sowie alle viruspositiven Proben werden am IVI mit Bestätigungs-ELISA und rRT-PCRs weiter untersucht. Falls ein genügend hoher Virusload vorhanden ist, wird zusätzlich die Sequenzierung und die Anzucht des Virus auf Zellkulturen versucht.
- Eine Abklärung der seropositiven Fälle in der Nordschweiz und im Bündnerland (je 6 bzw. 3 Fälle) wird durchgeführt. Dies beinhaltet eine serologische Untersuchung in nicht BTV-8 geimpften und eine virologische in geimpften Beständen. Sobald etabliert, soll der SNT für BTV-8 durchgeführt werden, um eine BTV-8 Infektion auszuschliessen. Dies wird aber vermutlich nur in Seren, welche hohe Antikörperreaktionen im ELISA aufweisen zu aussagekräftigen Resultaten führen (Worwa et al., in Vorbereitung).
- Untersuchung weiterer noch nicht getesteter Betriebe aus der CAE-Stichprobe aus dem Kanton Graubünden, sobald Tiere von Alp zurück kommen. Der Grund für diese zusätzlichen Untersuchungen im Bündnerland ist, weil dort (wie im Tessin) die Ziegen mit einer Chlamydienvakzine geimpft wurden und im Bündnerland bei den bisher getesteten Seren der CAE-Stichprobe relativ viele seropositive Proben gefunden wurden. Infektionen durch mit BTV-kontaminierte Impfstoffe wurden bereits bei Hunden beschrieben (Evermann et al., 1994). Falls dies der Fall wäre, müsste die Seroprävalenz in den Chlamydien-geimpften Regionen sehr hoch sein.
- Etablierung bzw. Versuch der TOV-Isolierung auf Zellkultur mit Spezialmethoden und zusätzlichen Zellen, da die bisher angewandten, für BTV etablierten Routinemethoden keinen Erfolg zeigten. Diese Arbeit wird durch den Einsatz der Doktorandin aus einem laufendem BT-Projekt( BVET Projekt 1.07.10) für 3 Monate durchgeführt (Untersuchungen sind bereits am Laufen).
2. Projektstufe
Am IVI vorgesehen:
Etablierung einer TOV-Diagnostik und Abklärung der Virusausscheidung, sofern das Virus in der 1. Projektstufe isoliert werden kann. Zurzeit können wir das TOV nur mittels PanBTV rRT-PCR und anschliessender Sequenzierung diagnostizieren, dies ist keine Methode, welche routinemässig angewendet werden kann.
- Ziel ist es, eine rRT-PCR zu etablieren, welche alle bisher in der Schweiz gefundenen TOV erkennt; dies beinhaltet die Sequenzierung weiterer Isolate (Nunningen, Oberhelfenschwil, Tessin und evtl. Bündnerland sowie Wallis).
- Etablierung eines SNT für TOV, um eine serologische Abgrenzung gegenüber anderen BTV, insbesondere BTV-8 zu ermöglichen.
- Evaluierung eines kommerziellen Bestätigungs-ELISAs welcher die TOV Antikörper zuverlässig erfasst, in Ergänzung zum vorhandenen VMRD ELISA.
- Etablierung einer Standard (Routine)-Methode für die TOV-Isolierung in Zellkultur.
- Die Etablierung der Diagnostik muss zum grössten Teil an Tierversuchsmaterial durchgeführt werden, da wir nur noch ganz wenig Feldmaterial besitzen, welches wir für die Virusisolierung in der 1. Projektstufe verwenden werden (müssen). Überdies muss für eine effiziente Diagnostik der Organtropismus bekannt sein und zudem eruiert werden, in welcher Blutzellfraktion das Virus am besten zu detektieren ist. Bei Feldmaterial haben wir im Blut bisher nur relativ geringe Virusmengen gefunden, sodass diese Proben eventuell als nicht optimal für die Diagnosestellung angesehen werden müssen. Die Infektion von Ziegen und Schafen soll mit hochtitrigen Viruslösungen (vergleichbar zu jenen Tierversuchen mit Schweizer Schafrassen, die mit BTV-8 infiziert wurden)S) durchgeführt werden.
- Wir nehmen im Moment an, dass das Virus auch über Culicoides übertragen werden kann; da das Virus bisher aber in Culicoides-Zellen nicht anzüchtbar war, könnte die Übertragung auch durch andere Mücken erfolgen oder sogar direkt durch Virus, welches von infizierten Tieren ausgeschieden wird. Die Tierversuche werden deshalb auch benutzt, um eine allfällige Virusausscheidung nachzuweisen, da eine grossangelegte Culicoides-Untersuchung (3. Projektstufe) nicht viel Sinn macht, wenn das Virus vom Tier ausgeschieden wird und nur in kleinen Mengen in Blut vorhanden ist.
3. Projektstufe.
Für weitere Abklärungen und Untersuchungen ist das Vorhandensein einer etablierten TOV Diagnostik Vorbedingung. Existiert keine etablierte TOV-Diagnostik (z.B. wenn das Virus nicht angezüchtet werden kann) ist man auf die nicht routinemässig anwendbare aufwendige Sequenzierung angewiesen. Die TOV-spezifische Untersuchung müsste sich somit auf wenige viruspositive Proben beschränken. Zudem wäre keine serologische Differenzierung des TOV von anderen BTVs möglich.
Arbeiten durch Doktorandin am ICMB und Ufficio Veterinaria Cantonale in Bellinzona:
- Falls aufgrund 1. Projektstufe Hinweise bestehen, dass das Virus aktuell noch zirkulieren könnte, sollen weitere serologische Untersuchungen bei noch nicht geimpften jungen Rindern und Schafen (>3 Monate, damit keine maternalen Antikörper mehr vorhanden sind) durchgeführt werden. Ebenso sollen Ziegen, welche im 2008 noch serologisch negativ waren (Ziegen wurden und werden im Tessin nicht geimpft) untersucht werden. Gesamthaft sollen mindestens 40 Betriebe mit je 5-20 Proben getestet werden à 400 Proben.
- Zuerst erfolgt eine serologische Untersuchung mittels VMRD ELISA. Bei seropositiven Tieren wird ein Virusnachweis mittels PanBTV rRT-PCR-IVI durchgeführt. Proben von viruspositiven Tiere werden ans IVI geschickt und dort aufbewahrt, bis die TOV-spezifischen Methoden etabliert sind (SNT, rRT-PCR, Zellkultur) und danach weiter untersucht (IVI).
- Falls keine Virusausscheidung in 2. Projektstufe beobachtet werden konnte, ist die Virusübertragung durch stechende Insekten wahrscheinlich und Culicoides Untersuchung macht Sinn.
Die Untersuchung von Culicoides und ggf. anderen blutsaugenden Insekten wird zusammen von ICMB und IPZ durchgeführt, wobei noch nicht klar abgemacht ist, welche Arbeiten von welchem Institut durchgeführt werden sollen. Dies wird Gegenstand von Verhandlungen beider Institute anfangs 2009 sein:
- Aufstellen von Mückenfallen in der Nähe von infizierten Beständen, Sammeln und Typisierung der Gnitzen. Solange nicht klar ist, dass primär oder ausschliesslich Culicoides als Überträger in Frage kommen, zusätzliches Sammeln von tag- und nachtaktiven Mücken.
- Da im Tessin auffällig viele Ziegen seropositiv sind und viele der Tiere den ganzen Sommer und bis in den Spätherbst auf den Alpen gehalten werden, muss evtl. eine Infektion auf den Alpweiden in Betracht gezogen werden, deshalb müssten allenfalls auch Insektenfallen auf den Alpen aufgestellt werden.
- Getrennte Analyse der gefangenen blutvollen und blutleeren Culicoides mittels PanBTV rRT-PCR-IVI. Am Anfang werden relativ grosse Pools analysiert, sobald BTV-positive blutleere Pools gefunden werden, werden kleinere Pools untersucht, um genauere Angaben über die Art der positiven Gnitzen machen zu können. Positive Proben werden aufbewahrt und für Nachweis mit TOV-spezifischen Methoden ans IVI gesandt. Viruspositive, blutleere Culicoides sind ein Hinweis, dass das TOV durch Culicoides übertragen werden kann. Blutvolle sind ein Zeichen dafür, dass TOV im Tessin aktuell zirkuliert. In einer ersten Phase sollen 200 Pools untersucht werden.
- Analyse von Gnitzen-Pools aus dem 2008, welche von IPZ aufbewahrt wurden (sowohl blutvolle als auch blutleere, aber getrennt voneinander), dies mittels PanBTV rRT-PCR-IVI. Vorgesehen ist auf alle Fälle die Analyse von Pools aus dem Tessin und der Region Toggenburg. Falls sich in anderen Gegenden der nördlichen Schweiz Hinweise auf ein Vorkommen des TOV ergeben, sollen auch Pools aus diesen Regionen untersucht werden. Damit könnte bewiesen werden, dass das TOV auch 2008 noch zirkuliert hat.
- Analyse von anderen bereits gefangenen Mücken oder je nach Situation noch zusätzlichen Culicoides-Pools, falls aus bisherigen Untersuchungen von Culicoides keine positiven Resultate erhalten wurden.
Arbeiten am IVI
- Falls sich in der 1. Projektstufe und den Untersuchungen von alten Culicoides-Pools zeigt, dass es sich um ein Infektionsgeschehen handeln könnte, welches schon seit Längerem am laufen ist, sollen aus alten Serumbanken Proben von den entsprechenden Gegenden serologisch auf BTV (respektiv auf TOV) untersucht werden. Je nach aktuell betroffenen Tierarten werden stichprobenartig Serumbank-Seren, d.h. Ziegeseren von 1998, Rinderseren von 2005 oder Schafseren von 2007 nachuntersucht.
- Falls positive Reagenten in der Stichprobe oder in den anderen Labors gefunden werden, wird eine PanBTV rRT-PCR-IVI und eine TOV-spezifische PCR oder Sequenzierung durchgeführt sowie eine Isolation des Virus aus geeigneten Proben versucht. Bei aktuell entnommenen viruspositiven Proben werden von den betroffenen Betrieben zusätzliche Proben angefordert.
- Epidemiologische Auswertung der Daten mittels logistischem Regressionsmodell (kantonales Veterinäramt Tessin, BVET).
