Schlüsselwörter
(Deutsch)
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Pantoea agglomerans, Bakteriophagen, Streptomycin, Erwinia amylovora, Apfel, Birnen
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Schlüsselwörter
(Englisch)
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Pantoea agglomerans, bacteriophage, streptomycin, Erwinia amylovora, apple, pear
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Kurzbeschreibung
(Deutsch)
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Feuerbrand verursacht durch Erwinia amylovora ist die grösste Bedrohung für die nachhaltige Apfel- und Birnenproduktion in der Schweiz. Durch phytosanitäre Massnahmen, die es seit den 60er Jahren gibt, konnte die Einführung und Ausbreitung dieser Krankheit zunächst zwar effizient verzögert werden, sie tritt heute jedoch in den meisten Anbaugebieten von Kernobst auf. Strenge Hygienerichtlinien spielen bei der Eindämmung einer Epidemie weiterhin eine wichtige Rolle, indem Inokulumreservoire (Infektionsherde) entfernt werden. Ein zuverlässiger Schutz gegen die verheerenden Verluste stützt sich derzeit allerdings auf die beschränkte Anwendung von Streptomycin während der Blütezeit ab. Alternative, umweltfreundliche Produkte müssen langfristig Antibiotika ersetzen. Dieses Projekt beschäftigt sich mit der Entdeckung und Entwicklung effektiver biologischer Pflanzenschutzmittel als eine solche alternative Möglichkeit, die sich sowohl für biologische als auch konventionelle Produktionssysteme anbieten.
Modul 1 beschäftigt sich mit der Entdeckung natürlicher Antagonisten, die ökologisch auf Schweizer Obstplantagenbedingungen abgestimmt sind. Pseudomonas-Isolate werden auf inhibitorische Aktivität gegen E. amylovora in immer ausgedehnteren Versuchsreihen untersucht, angefangen mit Laboruntersuchungen über Quarantäne-Gewächshausversuche mit Apfelbäumen bis hin zu kontrollierten Feldversuchen. Bakteriophagen, Viren, die Bakterien infizieren, aber für Pflanzen und Tiere ungefährlich sind, werden aus Obstplantagen isoliert und auf die Fähigkeit, speziell das Feuerbrandpathogen zu töten, untersucht. Phagen, die gegen ein breites Spektrum an E. amylovora Genotypen wirksam sind, werden in Bezug auf ihre Wirksamkeit bei der Bekämpfung des Feuerbrands bei Apfelbäumen evaluiert. Die vielversprechendsten Phagen werden mit Hilfe der Genomsequenzierung charakterisiert, um die Wirkmechanismen zu identifizieren, und diese Mechanismen werden auf eine mögliche Verwendung in der Feuerbrandbekämpfung untersucht. Modul 2 beschäftigt sich mit der Optimierung der Biokontrollleistung kommerzieller Pantoea agglomerans Stämmen, die ausserhalb der Schweiz bereits erhältlich sind, um den Weg für Produkte frei zu machen, die für Schweizer Produzenten marktreif sind. Die Optimierung der Wirksamkeit hängt von einem umfassenden Wissen über die Wirkmechanismen und den bestimmenden Faktoren der ökologischen Fitness der Antagonisten ab. Die Klärung dieser entscheidenden genetischen Elemente wird durch eine komplette Genomsequenzierung der kommerziellen Stämme optimiert und beschleunigt. Mutationsanalysen werden bakterienhemmende Metabolite und Regulatoren für den biologischen Pflanzenschutz identifizieren. Dadurch werden die Grundlagen für die Entwicklung von Formulierungs- und Anwendungsmethoden gelegt, die die Leistungsfähigkeit von Pantoea gegen Feuerbrand verbessern. Ausserdem vereinfacht dies die zielstrebige Entdeckung höchst effektiver Schweizer Isolate.
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Kurzbeschreibung
(Englisch)
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Fire blight caused by Erwinia amylovora is the main threat to sustainable apple and pear production in Switzerland. While phytosanitary measures in place since the 1960s effectively delayed the introduction and spread of this disease, it has now become established across much of the pome fruit growing regions. Strict sanitation guidelines continue to serve a key role in reducing epidemic severity by removing inoculum reservoirs. However, reliable protection against devastating losses currently relies on restricted application of streptomycin during the flowering period. Alternative, environmentally-friendly control products are needed for long-term replacement of antibiotics. This project focuses on the discovery and development of effective biological control as such an alternative option that is equally compatible with organic and conventional production systems.
Module 1 focuses on the discovery of natural antagonists that are ecologically attuned to Swiss orchard conditions. Pseudomonas isolates will be screened for inhibitory activity against E. amylovora in scale-up trials from lab assays, to quarantine greenhouse tests with apple trees and finally in controlled field trials. Bacteriophage, viruses that infect bacteria but are harmless to plants and animals, will be isolated from orchards and screened for ability to specifically kill the fire blight pathogen. Phage effective against the widest spectrum of E. amylovora genotypes will be evaluated for efficacy to control fire blight disease in apple trees. The most promising phages will be characterized using genome sequencing to identify the mechanisms of action, and these mechanisms will be studied for potential exploitation to deliver the highest level of fire blight control activity. Module 2 focuses on optimizing the biocontrol performance of commercial Pantoea agglomerans strains that are already available outside Switzerland in order to pave the way for delivering products that are market-ready to Swiss producers. Optimizing efficacy depends upon a thorough understanding of mechanisms of action and determinants of antagonist ecological fitness. Elucidating these critical genetic elements will be streamlined by complete genome sequencing of commercial strains. Mutational analysis will identify antibacterial metabolites and regulators of biocontrol. This will lay the foundation for developing formulation and application methods that improve the performance of Pantoea against fire blight. It will also facilitate the streamlined discovery of highly effective Swiss isolates.
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Projektziele
(Deutsch)
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· Evaluierung vonPseudomonas-Isolaten für Wirksamkeitsversuche im Labor, Gewächshaus und Feld.
· Isolierung und Untersuchung von Bakteriophagen für die biologische Feuerbrandbekämpfung.
· Charakterisierung wirksamer Bakteriophagenisolate und Definition der Wirkmechanismen.
· Genomsequenzierung kommerzieller Pantoea agglomerans Biokontrollstämme.
· Identifizierung der Wirkmechanismen und bestimmenden Faktoren der ökologischen Fitness. · Entwicklung genetischer Marker für wichtige Biokontrollgene zur Optimierung der Leistungsfähigkeit und schnelleren Entdeckung neuer Antagonisten.
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Projektziele
(Englisch)
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· Evaluate Pseudomonas isolates for biocontrol efficacy in lab-greenhouse-field trials.
· Isolate and screen bacteriophage for fire blight biocontrol activity.
· Characterize effective bacteriophage isolates and determine mechanisms of action.
· Genome sequence commercial Pantoea agglomerans biocontrol strains.
· Identify mechanisms of action and determinants of ecological fitness.
· Develop genetic markers for key biocontrol genes for use in optimizing performance and streamlined discovery of new antagonists.
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Umsetzung und Anwendungen
(Deutsch)
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Feuerbrand ist eine grosse Bedrohung für die Kernobstindustrie und die Erhaltung der Landschaften mit Altbestand an Birn- und Apfelbäumen. Die Entwicklung des biologischen Pflanzenschutzes ist unerlässlich, damit Antibiotika durch umweltfreundliche Alternativen ersetzt werden können. Trotz jahrzehntelanger Forschungsarbeit bietet der biologische Pflanzenschutz immer noch keinen ausreichenden und zuverlässigen Schutz. Dieses Projekt wird versuchen, neue und wirksamere natürliche Antagonisten, Pseudomonas und Bakteriophage zu entdecken. Es wird ausserdem die entscheidenden Faktoren der Feuerbrandbekämpfung in der wirksamsten derzeit verfügbaren Gruppe der Biokontrollstoffe identifizieren, Pantoea agglomerans, und diese Erkenntnisse zur Steigerung der Leistungsfähigkeit unter den Bedingungen Schweizer Obstplantagen verwenden. Dies wird neue Produkte für die Schweizer Industrie liefern, die als wirksame Alternative zu Antibiotika angeboten werden können und die sich sowohl für die biologische als auch konventionelle Apfel-/Birnenproduktion eignen.
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Umsetzung und Anwendungen
(Englisch)
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Fire blight is a major threat to the pome fruit industry and to sustaining the cornerstone landscape old-growth pear and apple trees. Development of biocontrol is essential for replacing antibiotics with an environmentally friendly alternative. Despite decades of research effort, biocontrol still offers insufficient and unreliable protection. This project will try to discover new and more effective natural antagonists, Pseudomonas and bacteriophage. It will also identify the critical determinants of fire blight control activity in the most effective group of biocontrol agents that are currently available, Pantoea agglomerans, and apply these insights to improve performance under Swiss orchard conditions. This will deliver new products for the Swiss industry to market as effective alternatives to antibiotics that are compatible with conventional and organic apple/pear production.
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Neue Kenntnisse/Literatur
(Deutsch)
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· Rezzonico, F., T.H.M. Smits, E. Montesinos, J.E. Frey, und B. Duffy. 2009. Genotypic comparison of Pantoea agglomerans plant and clinical strains. BMC Microbiology 9:204.
· Rezzonico, F., Stockwell, V.O., und Duffy, B. 2009. Plant agricultural streptomycin formulations do not carry antibiotic resistance genes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 53:3173-3177.
· Paternoster, T., Duffy, B., Gessler, C., und Pertot, I. 2009. Quantification of nicotinic acid and its analogs and derivates in apple and pear blossoms using high-performance liquid chromatography- -diode array-electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Food and Agricultural Chemistry 57:10038–10043.
· Hagens, S., und Loessner, M.J. 2007. Application of bacteriophages for detection and control of foodborne pathogens. Applied Microbiology and Biotechnology 76:513-519.
· Smits THM, Rezzonico F, Pelludat C, Stockwell VO, Goesmann A, Frey, J.E., und Duffy, B. 2009. Complete genome sequencing of Pantoea agglomerans strain C9-1. IOBC/wprs Bulletin 43:375-378.
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Neue Kenntnisse/Literatur
(Englisch)
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· Rezzonico, F., T.H.M. Smits, E. Montesinos, J.E. Frey, and B. Duffy. 2009. Genotypic comparison of Pantoea agglomerans plant and clinical strains. BMC Microbiology 9:204.
· Rezzonico, F., Stockwell, V.O., and Duffy, B. 2009. Plant agricultural streptomycin formulations do not carry antibiotic resistance genes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 53:3173-3177.
· Paternoster, T., Duffy, B., Gessler, C., and Pertot, I. 2009. Quantification of nicotinic acid and its analogs and derivates in apple and pear blossoms using high-performance liquid chromatography- -diode array-electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Food and Agricultural Chemistry 57:10038–10043.
· Hagens, S., and Loessner, M.J. 2007. Application of bacteriophages for detection and control of foodborne pathogens. Applied Microbiology and Biotechnology 76:513-519. · Smits THM, Rezzonico F, Pelludat C, Stockwell VO, Goesmann A, Frey, J.E., and Duffy, B. 2009. Complete genome sequencing of Pantoea agglomerans strain C9-1. IOBC/wprs Bulletin 43:375-378.
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Arbeitsvorgang/Stand der Arbeiten
(Deutsch)
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Modul 1: Eine ganze Reihe von neuen Bakteriophagen spezialisiert auf E. amylovora wurde aus Schweizer Kernobstsystemen isoliert. Die Phagen wurden mit Hilfe der Elektronenmikroskopie charakterisiert und ihre Genome wurden mit Hilfe von RFLP und PFGE analysiert. Die Analyse des Wirtsbereichs hat ergeben, dass die meisten unserer neu isolierten Phagen ein breites Spektrum an E. amylovora Stämmen infizieren (und abtöten) (d.h. Schweizer, europäische und globale Pathogengenotypen) und dass sie für möglicherweise nützliche Feuerbrand-Biokontrollbakterien kein Risiko darstellen (z.B. Pantoea agglomerans, Pseudomonas fluorescens). Es stellte sich heraus, dass für die biologische Bekämpfung von E. amylovora im Reagenzglas Mischungen von Stämmen dieser Phagen wirksamer sind als einzelne Phagen und Bioassays in den Plantagen (z.B. an blühenden Apfelbäumen) sind in Vorbereitung. Die kompletten Genome für drei der vielversprechendsten Phagen wurden sequenziert und liessen Virulenzmechanismen erkennen. Eine Phagen-Depolymerase, die die lebenswichtige Kapsel um die E. amylovora-Zellen zerstört, wurde zur möglichen Weiterentwicklung für die Bekämpfung des Feuerbrands identifiziert. Vorläufige Daten lassen darauf schliessen, dass die Phagenaktivität möglicherweise ein Zusammenwirken der Phageninfektion und der Depolymerase-aktivität erfordert. Die Feuerbrandbekämpfung dieser Depolymerase in planta, ihre Rolle bei der Phagenwirksamkeit und die Entdeckung zusätzlicher bakterienhemmender Phagenenzyme wird in der zweiten Phase des Projekts weiter verfolgt.
Modul 2: Grosse Fortschritte wurden in der Klärung der Wirkmechanismen für die biologische Bekämpfung von Feuerbrand mit Pantoea -Stämmen erzielt. Dies wurde durch die Fertigstellung der ersten vollständigen Genome für zwei kommerzielle Stämme von Pantoea agglomerans (E325, BloomTime) und P. vagans (C9-1, Blight Ban C9-1) erreicht. Gene für mehrere bakterienhemmende oder regulatorische Elemente wurden identifiziert, einschliesslich der kompletten Operons für die bakterienhemmenden Peptide Pantocin und Herbicolin I. Diese haben sich alle als entscheidend für die biologische Schutzaktivität von Pantoea gegen den Feuerbrand herausgestellt. Angewandte Genomik erleichterte den Entwurf quantitativer PCR-Methoden, die in der zweiten Phase des Projekts angewendet werden sollen, und zwar (i) zur Klärung von Umweltmodulatoren der Genexpression und Biokontrollaktivität sowie (ii) für die Entwicklung neuartiger Methoden zur Optimierung und Beschleunigung der Entdeckung neuer Biokontrollstämme, die besser an Schweizer Verhältnisse angepasst sind.
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Arbeitsvorgang/Stand der Arbeiten
(Englisch)
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Module 1: A diverse collection of new bacteriophages specific for E. amylovora was isolated from Swiss pome fruit systems. Phages were characterized using electron microscopy and their genomes were analyzed using RFLP and PFGE. Host range analysis showed that most of our newly isolated phages infect (and kill) a broad range of E. amylovora strains (i.e., Swiss, European, global pathogen genotypes), and they are not a risk to potentially beneficial fire blight biocontrol bacteria (e.g., Pantoea agglomerans, Pseudomonas fluorescens). Strain mixtures of these phages were found to be more effective than individual phages for biocontrol of E. amylovora in vitro, and plant bioassays (e.g., on flowering apple trees) are under way.
Complete genomes for three of the most promising phages were sequenced, revealing virulence mechanisms. A phage depolymerase that aggressively degrades the vital capsule surrounding E. amylovora cells was identified for potential further development to control fire blight. Preliminary data suggests that phage activity may involve synergy of phage infection and depolymerase activity. The fire blight control activity of this depolymerase in planta, its role in phage efficacy, and discovery of additional antibacterial phage enzymes will be pursued in the second project phase.
Module 2: Major advances were made in elucidating the mechanisms of action for fire blight biocontrol by Pantoea strains. These were achieved by finishing the first complete genomes for two commercial strains of Pantoea agglomerans (E325, BloomTime) and P. vagans (C9-1, Blight Ban C9-1). Genes for several antibacterial or regulatory elements were identified, including the complete operons for the antibacterial peptides pantocin and herbicolin I. These have all been shown to be critical for the fire blight biocontrol activity of Pantoea. Applied genomics facilitated the design of quantitative PCR methods that will be applied in the second project phase for (i) elucidating environmental modulators of gene expression and biocontrol activity, and (ii) for developing novel methods to streamline the discovery of new biocontrol strains better adapted to Swiss conditions.
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Kunden/Berichterstattung
(Deutsch)
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Hersteller von biologischen Pflanzenschutzmitteln, Schweizer Kernobstproduzenten, Umweltverbände, internationale Forschungskonsortien
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Kunden/Berichterstattung
(Englisch)
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Biocontrol manufacturers, Swiss pome fruit producers, environmental interest groups, international research consortia
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