Methodenentwicklung für die Tierartendifferenzierung mittels Nukleinsäuren-Amplifikationstechnologie

• Forschungsstelle: BLV
• Projektnummer: 1.97.04

Schlüsselwörter (Deutsch)

Tierartendifferenzierung, Wildtiere, PCR, RFLP, cyt b

Kurzbeschreibung (Deutsch)

Tierarten können aufgrund verschiedener Inhaltsstoffe identifiziert werden. Sehr oft werden bestimmte Proteine für den Nachweis der Identität herangezogen. Durch isoelektrisches Fokussieren (IEF) von Muskelproteinen lassen sich Tier und Fischarten identifizieren. Da durch die Lebensmittelverarbeitung Proteine denaturiert werdenkonnen, sind IEF-Nachweise von prozessierten Lebensmitteln oft erheblich erschwert. Auf diesem Gebiet hat der Einsatz der Molekularbiologie erhebliche Fortschritte gebracht, da eine Identifikation mittels Nukleinsäuren auch in prozessierten Lebensmitteln möglich ist.
Um die Tierart von Fleisch zu identifizieren wurde im Labor für Lebensmittelchemie der Universität Bern ein PCR System auf dem cytB Gen entwickelt. Mit der cytB-PCR-Methode lassen sich ebenfalls Fleischmischungen (z.B. Würste) bestimmen.
Es sollen nun folgende Fragen beantwortet werden:
- Welche DNA-Extraktionsmethoden sind für stark prozessierte Produkte tierischen Ursprungs am besten geeignet?
- Wie können Spezies von unbekannten Taxa eindeutig mittels molekularbiologischen Techniken identifiziert werden?
- Wie kann eien Datenbank für bedrohte Tierarten im 'Desktop'-Format aufgebaut werden?

Projektziele (Deutsch)

Ziel dieses Projektes war es die am besten geeigneten DNA-Extraktionsmethoden für prozessierte Lebensmittel zu bestimmen. Wildtierarten, sowie Caviar- bzw. Störarten sollten mit Hilfe molekularbiologischer Methoden differenziert werden.

Abstract (Deutsch)

Unter den untersuchten DNA-Extraktionsmethoden (2x Promega, 1x Qiagen) lieferte der Wizard Resin Kit von Promega die beste Qualität an DNA (Sensitivität), der Wizard SV Kit war im Handling am einfachsten und der Qiagen Kit am besten die Reinheit der DNA betreffend (Abs. 260/280nm). Die aus zertifizierten Referenzproben extrahierte DNA von Wildtieren bzw. Caviar Proben wurde mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion (PCR) amplifiziert und zunächst sequenziert, um die RFLP-Muster zu berechnen. Dazu wurde ein Genabschnitt amplifiziert, der auf dem Übergang von der t-RNA Glu zum cytochrom b Gen liegt. Es wurde ein Differenzierungsystem bestehend aus 6 Restriktionsenzymen (RE) erstellt, mit dem mind. 11 einheimische Wildtiere eindeutig durch ihre charakteristischen Restriktionsmuster von 2-3 Restriktionsenzymen differenziert werden konnten. Die drei kommerziellen Caviar Arten Beluga, Ostern und Sevruga konnten mit Hilfe von 2 RE eindeutig differenziert werden.
Ergebnisse und Bedeutung
Für die Routineanwendung ist der Wizard Resin Kit (Promega) auf Grund der geringeren Gefahr der Kreuzkontaminationen durch die Verwendung der Vacmans den anderen Zentrifugationssystemen vorzuziehen. Beim Qiagen Kit ist die eingesetzte Probenmenge so gering (ca. 10x weniger), dass bei grösseren, weniger homogenen Proben die Repräsentativität nicht immer gegeben sein wird.
Mit dem vorliegenden System ist es möglich, die Herkunft von Fleisch- oder Caviar-Proben schnell und einfach zu bestimmen. Die PCR-RFLP Methoden bietet gegenüber den bislang angewandten Methoden, wie Isoelektrische Fokussierung oder immunologische Methoden zudem den Vorteil, dass auch aus stark prozessierten und erhitzen Produkten DNA in ausreichender Qualität und Menge isoliert werden kann, um die Differenzierung durchzuführen.

Publikationen / Ergebnisse (Deutsch)

Abschlussbericht der Projektes, März 1998.

Wolf, Ch., (1998) PCR-RFLP Analyse von mitochondrialer DNA zur Wildtierarten Differenzierung, Schweizerische Gesellschaft für Lebensmittel- und Umweltchemie "Tag der Jungenwissenschaftler", Horw 1998.

Publikationen / Ergebnisse (Englisch)

Wolf, Ch., Rentsch, J., Hübner, Ph. (1998) PCR-RFLP analysis of mitochondrial DNA: A reliable method for species identification, submitted to J Agr Food Chem.

URL-Adressen (Deutsch)

http://www.admin.ch/bvet