Schlüsselwörter
(Deutsch)
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PRRSV, Sensitivität, PCR, Sequenzierung, Alveolarmakrophagen (SAM), Zelllinien, Virusnachweis
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Kurzbeschreibung
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Das Porcine Reproduktive und Respiratorische Syndrom (PRRS) ist eine neue Krankheit beim Schwein, die erst seit Anfangs der 90er Jahren in Europa aufgetreten ist. Einige Jahre zuvor war sie bereits in Nordamerika beobachtet worden. In vielen europäischen Ländern ist der grösste Teil der Schweinepopulation seropositiv bezüglich PRRS-Virus (PRRSV). So weisen in den Niederlanden und in Deutschland über 80% der Schweine Antikörper gegen PRRSV auf. Bei Schweinen aus der Schweiz wurde diese Krankheit bisher noch nie festgestellt. Epidemiologische Untersuchungen am IVI und Resultate aus der Routinediagnostik, wo alle Schweineseren auf PRRS-Antikörper untersucht werden, ergaben keine Anhaltspunkte auf eine PRRSV-Infektion des Schweizer Schweinebestandes. Da sich eine PRRSV-Infektion auch über die Luft ausbreiten kann; alle Länder, die der Schweiz angrenzen, PRRS-Seuchenfälle aufweisen und illegale Schweineimporte nie ausgeschlossen werden können, muss jederzeit mit dem Auftreten von PRRS in der Schweiz gerechnet werden.
Vom PRRSV existieren grundsätzlich zwei verschiedene Virustypen, der europäische und der nordamerikanische Typ, die sich sowohl genetisch wie auch antigenetisch unterscheiden. Es gibt neuerdings Hinweise, dass auch nordamerikanische PRRSV bzw. Impfviren in Europa zirkulieren.
Im Rahmen des hier beschriebenen Projekts soll der PRRSV-Nachweis verbessert werden. Neben den europäischen Isolaten sollen auch die nordamerikanischen Isolate und die Impfstämme mittels PCR erkannt werden können. Die Sensitivität der bereits am IVI vorhandenen PCR soll mit anderen publizierten PCRs und der PRRSV-Isolierung in Zellkulturen verglichen werden. Gleichzeitig soll eine neue PCR-Methode etabliert werden: Verwendung eines LightCyclers oder TaqMan um die PCR zu vereinfachen, um die Spezifität und Sensitivität zu erhöhen und einen grösseren Probendurchfluss zu ermöglichen. Weiter wird dUTP in Kombination mit Uracil-N-Glycosylase (UNG) verwendet um PCR-Kontaminationen vorzubeugen, dadurch wäre auch eine Möglichkeit gegeben, bei Bedarf, die stark kontaminationsgefährdete, aber sehr sensitive Nested-PCR zu etablieren. Mit der Etablierung einer weiteren PCR in einem variableren Genombereich soll die Sequenzierung der Virusisolate ermöglicht werden.
Der Nachweis von replikationsfähigem PRRSV in Zellkulturen muss verbessert werden. Bisher wurde das PRRSV auf Schweine-Alveolarmakrophagen (SAM) nachgewiesen. Die Bereitstellung dieser Zellen ist jedoch mit einem enormen Zeit- und Material-Aufwand verbunden, die Empfänglichkeit der Zellen für das Virus ist zudem vom Spendertier und vom Aktivitätszustand der SAM abhängig. Die Bemühungen gehen dahin, den Virusnachweis auf Zelllinien zu etablieren und nicht mehr auf den SAM zu führen. Zudem soll ein empfindlicheres System etabliert werden, um infizierte Zellen in diesen Zelllinien zu detektieren .
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Projektziele
(Deutsch)
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Bei der PRRSV-Diagnostik ist die PCR als Nachweismethode sehr wichtig, da PRRSV, abhängig vom Virusstamm, teilweise sehr schlecht in Zellkultur anzuzüchten und nachzuweisen ist. Zudem ist das PRRSV sehr labil, und kann seine Infektiosität rasch verlieren und ist somit nicht mehr mittels Zellkultur nachzuweisen.
Zur Etablierung der neuen bzw. verbesserten Methoden werden, um einen Infektionsversuch an Tieren zu umgehen, verschiedene PRRSV-Isolate aus Europa und Nordamerika im Rahmen unserer internationalen Zusammenarbeit beschafft. Im gleichen Kontext wird PRRSV-haltiges Organmaterial beschafft werden. Mit Hilfe dieses Materials und bereits am IVI vorhandenen Virusisolaten, ausgehend von am Institut bereits bestehenden Tests, werden die folgenden neuen und verbesserten Methoden etabliert:
a) Verbesserung des PRRSV-Nachweises mittels PCR:
- Gewinnung von Erkenntnissen über die Sensitivität der am IVI vorhandenen PCR im Vergleich zu anderen bereits publizierten PCRs und Methoden.
- Erfassung von nordamerikanischen PRRSV-Isolaten und Impfviren die genetisch verschieden von den europäischen Isolaten sind.
- Sequenzierung der Virusisolate um epidemiologische Aussagen über den Ursprung der Infektion machen zu können.
- Einführung der LightCycler oder Taq Man / UNG / dUTP Methode als Prototyp für andere diagnostische PCRs. Dadurch Verminderung der PCR-Kontaminationen, Erhöhung von Sensitivität und Spezifität.
- Nach Möglichkeit Einführung einer internen PCR-Kontrolle um Hemmungen in der PCR zu erkennen.
b) Verbesserung des PRRSV-Nachweises mittels Zellkultur:
- Virusnachweis auf Zelllinien, Herstellung eines eigenen, gut für PRRSV empfänglichen, Zellklones.
- Etablierung optimaler Zellkulturbedingungen, welche für die Virus-Adsorption und Replikation entscheidend sind.
- Optimierung der immunhistochemischen Färbung virusinfizierter Zellkulturen: Immunfluoreszenz oder Immunperoxidase-Färbung mit oder ohne Verstärker-Kit, Verwendung von polyklonalen- oder monoklonalen Antikörpern (mAk).
c) Laufende Aktualisierung der Literatur zu PRRS .
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Abstract
(Deutsch)
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Schlussbericht Projekt: Verbesserung der PRRS-Virus-Diagnostik, insbesondere der Nachweis der nordamerikanischen Virusisolaten
Christoph Egli
a) Verbesserung des PRRSV-Nachweises mittels PCR:
Drei bereits publizierte PCR-Methoden, die den Nachweis und die Unterscheidung von europäischen (EU) und nordamerikanischen (US) PRRS Viren in Zellkulturüberständen erlauben, wurden teilweise abgeändert in unserer Routine-Diagnostik eingeführt. Eine PCR erfasst alle Virusstämme, eine zweite die US und eine dritte die EU Virusstämme. Die zwei letzteren ermöglichen die Unterscheidung einzelner Isolate durch nachfolgende Sequenzierung der PCR Fragmente. Die abgeänderten Methoden erlauben es nun auch, das Virus direkt aus Organmaterial oder Serum nachzuweisen.
Die Sensitivität der neuen PCR's wurde mit der Virusisolation auf Zellkulturen verglichen. Es ist mit der US PRRSV spezifischen PCR und der PCR, die alle Virusstämme erfasst, möglich,
1 TCID50 zu detektieren. Die EU PRRSV-Nachweis ist etwa 10-mal weniger sensitiv. Die PCR's wurden zusätzlich mit der bereits am IVI vorhandenen PCR verglichen; die neuen Methoden sind viel sensitiver, insbesondere für den Nachweis der US PRRSV, die durch die alte IVI PCR praktisch nicht erfasst werden. Die Spezifität wurde mit anderen für Schweine relevante Viren überprüft.
b) TaqMan PCR
Eine PCR auf dem TaqMan System konnte erfolgreich etabliert werden. In nur einer PCR können sowohl das EU als auch das US Virus detektiert und unterschieden werden. Die Methode ist sehr zuverlässig, spezifisch und ebenso sensitiv wie die neu entwickelten konventionellen PCR's. Die Methode ist ebenfalls geeignet, um aus Organmaterial bzw. Serum direkt das Virus nachzuweisen. Da wir mit der TaqMan PCR und der konventionellen PCR zwei Virusnachweismethoden haben, müssen nun Bestätigungen einer positiven PCR nicht mehr zwingend mit der sehr aufwendigen Zellkulturisolierung durchgeführt werden.
Die TaqMan PCR ermöglicht zusätzlich die Untersuchung von grossen Probenmengen.
c) Virusnachweis auf Zellkulturen
Es gelang uns nicht, eine Zelllinie zu etablieren, auf der zuverlässig EU PRRSV isoliert werden kann. Für die Virusisolation auf Zellkulturen muss daher immer noch auf die aufwendige Alveolar-Makrophagen-Kultur zurückgegriffen werden. Allerdings gelang es uns, ein EU PRRSV an Marc 145 Zellen zu adaptieren, was die Grundlage zur Etablierung einer neuen Methode zum PRRS Antikörpernachweis darstellt. EU bzw. US PRRSV infizierte Zellen exprimieren das PRRSV Antigen, Antikörper im Testserum können daran binden und mit einem weiteren Fluoreszenz markierten Antikörper detektiert werden. Diese Methode kann als zweiter Test zur Abklärung positiver ELISA Resultate eingesetzt werden. Der neu entwickelte Test befindet sich allerdings noch in der Validierungsphase, diese wird im Verlaufe des nächsten halben Jahres abgeschlossen werden.
Publikationen:
Eine Publikation über die TaqMan PCR wird bis Ende Jahr eingereicht.
Eine weitere Publikation über den Antikörpernachweis mittels zellkulturadaptiertem EU PRRSV soll zusammen mit der neuen ELISA Methode (Projekt Serologie PRRS, Torsten Säuberlich) erstellt werden.
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Publikationen / Ergebnisse
(Deutsch)
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Egli, Christoph (2001): Quantitative TaqMan RT-PCR for the detection and differentiation of European and North American strains of porcine reproductive and respiratory syndrom virus (PRRSV). Inaugural-Dissertation, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Bern, Switzerland.
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Publikationen / Ergebnisse
(Englisch)
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Egli, Christoph (2001): Quantitative TaqMan RT-PCR for the detection and differentiation of European and North American strains of porcine reproductive and respiratory syndrom virus (PRRSV). Inaugural-Dissertation, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Bern, Switzerland.
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