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Forschungsstelle
BLV
Projektnummer
1.95.01
Projekttitel
Aufbau eines Referenzzentrums für NCD und ESPV-Nachweis im Fleisch

Texte zu diesem Projekt

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Schlüsselwörter
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Kurzbeschreibung
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Erfasste Texte


KategorieText
Schlüsselwörter
(Deutsch)
Virus der Klassischen Schweinepest, KSPV, RT-PCR, Zellkultur, Immunhistologie, Muskelfleisch, Newcastle Disease, ELISA, Ringtest, Seroepidemiologie, Tierversuch
Kurzbeschreibung
(Deutsch)
Es werden insgesammt 3 Untersuchungen durchgeführt:
1. Entwicklung eines Nachweises des Virus der Klassischen Schweinepest im Muskelfleisch
In mehreren europäischen Ländern und der Schweiz traten in den letzten Jahren Ausbrüche von Klassischer Schweinepest (KSP) auf. Schweinefleisch, insbesondere auch von Wildschweinen wird vom Ausland in die Schweiz importiert. Es wäre deshalb von Vorteil, wenn man das KSP-Virus (KSPV) direkt aus dem Muskelfleisch nachweisen könnte. Es ist bekannt, dass das KSPV vor allem im lymphatischen Gewebe vorkommt und die Muskulatur kein eigentliches Zielorgan für KSPV ist. Die geringen Virusmengen in der Muskulatur erfordern deshalb eine besonders sensitive Virusnachweismethode.
Anlässlich von KSPV-Infektionsversuchen an Hausschweinen wurden diverse Organe inklusive Muskulatur von mit verschiedenen KSPV-Stämmen infizierten Tieren mit Hilfe von Zellkultur, Immunhistologie und RT-PCR auf KSPV untersucht. Bei der Probenaufbereitung für die RT-PCR wurden verschiedene Virusanreicherungs-methoden getestet. Die Resultate des Virusnachweises in der Muskulatur wurden mit dem Virusnachweis in anderen Organen und im Blut verglichen.PT-PCR war die empfindlichste Methode zum KSPV-Nachweis im Muskelfleisch. Eine vorgängige RNA-Anreicherung ist bei Muskelproben unerlässlich; gute Erfahrungen wurden mit einer Trizol®-Extraktion gemacht. Allerdings waren nur 58% der Muskelproben von den in Zielorganen positiven Schweinen mittels RT-PCR und nur 40% mittels Zellkultur positiv. Der Virusnachweis in der Muskulatur war vor allem bei klinisch erkrankten, mit hochvirulenten KSPV-Stämmen infizierten Schweinen positiv. Der KSPV-Nachweis im Muskelfleisch scheint unzuverlässig zu sein, wenn Proben von klinisch nicht schwer erkrankten Tieren untersucht werden.
2. Aufbau eines Referenzzentrums für Newcastle Disease (ND)
In der Schweiz traten in den letzten Jahren sporadisch Fälle von Atypischer Geflügelpest (Newcastle Disease (ND)) auf. Die ND-Diagnostik am IVI soll ausgebaut und auf zuverlässigen, zeitgerechten Methoden basieren, die zum Teil aus Kostengründen in den privaten und kantonalen Laboratorien nicht durchgeführt werden können. Es soll eine Diagnostik etabliert werden, mit der es möglich ist, statt mittels Tierversuchen (Bestimmung des Pathogenitätsindex in Küken) mittels einer schnellen molekularbiologischen Analyse ein ND-Virusisolat zu charakterisieren. Als Referenzlabor hat das IVI zudem Ringversuche in privaten und kantonalen Laboratorien zu organisieren.Es wurde ein zuverlässiger ND-Virusnachweis aus Organen mittels RT-PCR etabliert. Mit Hilfe eines Tierversuches wurde abgeklärt (i) zu welchem Zeitpunkt und (ii) in welchen Organen das ND-Virus (NDV) am besten mit der RT-PCR nachgewiesen werden kann. Die Resultate wurden mit der Referenzmethode, dem Virusnachweis auf Hühnerembryonen sowie mit dem Nachweis in Zellkulturen verglichen. Viren wurden im F1/F2 Genombereich des Fusionsproteins sequenziert, um Aussagen über ihre Pathogenität machen zu können. Für serologische Untersuchungen wurden verschiedene kommerziell erhältliche ELISA's untereinander und mit dem Referenztest, dem Hämagglutinationshemmtest (HAH) verglichen. Mit vom Tierversuch und von Schweizer Seuchenausbrüchen gewonnenen Seren wurde ein Ringversuch in den ND-Diagnostiklabors der Schweiz durchgeführt. Dieser wurde in enger Zusammenarbeit mit dem O.I.E. Referenzlabor CVL Weybridge und der BFA, Insel Riems durchgeführt.Die verwendete RT-PCR ist für den schnellen NDV-Nachweis in Organen geeignet, scheint aber in ihrer Empfindlichkeit nicht in allen Fällen an den Virusnachweis auf Hühnerembryonen heranzukommen, infizierte Tiere werden aber zuverlässig erfasst. Die RT-PCR bietet eine Grundlage zur Sequenzierung der Virusisolate. Der Virusnachweis auf Zellkulturen ist etabliert, er eignet sich gut, um NDV in Allantoisflüssigkeit nachzuweisen, dies als Alternative zum Nachweis mittels Hämagglutination. Diverse kommerziell erhältliche ELISA's sind ebenso zuverlässig für den ND-Antikörpernachweis zu verwenden, wie der HAH, dies zeigen auch die Resultate aus den durchgeführten Ringtests.
3.Verbesserung der Newcastle Disease-Diagnostik und seroepidemiologische Untersuchungen bei Legehennen
Im Rahmen des Aufbaus eines Referenzzentrums für atypische Geflügelpest (= Newcastle Disease, ND) sollte speziell der ND-Virusnachweis mittels RT-PCR weiterentwickelt werden. Die RT-PCR mit Organmaterial und falls möglich mit Kotproben sollte mit Hilfe eines Tierversuches an Hühnern etabliert werden. Eine ND-Diagnostik mit Kotproben ist insofern von Bedeutung, da diese Proben auch bei Wildvögeln zu erheben sind. Weiter wurde abgeklärt, wie hoch die ND-Seroprävalenz beim Nutzgeflügel in der Schweiz ist, um so eine Aussage über den ND-Seuchenstatus machen zu können.Für die Etablierung der RT-PCR an Organmaterial wurden Küken, welche mit ND-Impfstoffen geimpft wurden, euthanasiert und die wichtigsten Organe mit mehreren Methoden für den Virusnachweis aufgearbeitet. Danach wurden Hühner im Rahmen eines Tierversuches mit dem ND-Feldisolat aus Safnern infiziert und das ND-Virus (NDV) in den Organen und im Kot mittels RT-PCR nachgewiesen. Wir erhielten so Aufschluss darüber, (i) zu welchem Zeitpunkt nach der Infektion und (ii) in welchen Organen das NDV nachzuweisen ist.
Für die seroepidemiologischen Untersuchungen beim Nutzgeflügel wurden im Geflügelschlachthof der SEG in Zell je 30 Blutproben von 260 Legehennenherden aus der ganzen Schweiz gesammelt und mit einem ND-Blocking-ELISA auf Antikörper gegen NDV untersucht. Die Resulate wurden mit einem neu entwickelten Computer Simulations Modell auf Herdenbasis statistisch ausgewertet. Die Untersuchungen ergaben das die Schweiz nicht NDV-frei ist.
Mittels RT-PCR ist es möglich aus Organen, sowohl in mit ND-Impfvirus, als auch in mit Feldvirus infizierten Tieren das NDV zuverlässig nachzuweisen, die Sensitivität der RT-PCR, verglichen mit der herkömmlichen Virusisolation auf Hühnerembryonen war höher, insbesondere bei Tieren, die bereits Antikörper gegen das NDV gebildet hatten. Das Virus konnte vor allem im Magen-Darm- und Atmungstrakt, sowie in Nieren und Konjunktiven nachgewiesen werden. Positive Resultate liegen auch von Kotproben vor.
Da die Resultate einer RT-PCR bereits innerhalb eines Arbeitstages verfügbar sind, ist diese Diagnostikmethode sehr geeignet, um bei Verdachtsfällen schnell einen ersten Befund zu liefern. Ausserdem besteht die Möglichkeit, die amplifizierte DNA weiter zu charakterisieren, um Rückschlüsse auf die Pathogenität des Virus zu erhalten.
In der seroepidemiologischen Studie wurden 256 der 260 mit dem ELISA getesteten Herden als NDV-Antikörper negativ beurteilt. Vier Herden waren positiv, ohne hingegen je ND-typische Symptome gezeigt zu haben, das bedeutet, dass diese Infektionen durch lentogene d.h. wenig krankmachende NDV oder durch Impfviren verursacht wurden.
Projektziele
(Deutsch)
Aufbau eines Referenzzentrums für Newcastle Disease und Nachweis von Europaischem Schweinepest-Virus im Fleisch
Abstract
(Deutsch)
Es wurden insgesammt 3 Untersuchungen durchgeführt:
1. Entwicklung eines Nachweises des Virus der Klassischen Schweinepest im Muskelfleisch
In mehreren europäischen Ländern und der Schweiz traten in den letzten Jahren Ausbrüche von Klassischer Schweinepest (KSP) auf. Schweinefleisch, insbesondere auch von Wildschweinen wird vom Ausland in die Schweiz importiert. Es wäre deshalb von Vorteil, wenn man das KSP-Virus (KSPV) direkt aus dem Muskelfleisch nachweisen könnte. Es ist bekannt, dass das KSPV vor allem im lymphatischen Gewebe vorkommt und die Muskulatur kein eigentliches Zielorgan für KSPV ist. Die geringen Virusmengen in der Muskulatur erfordern deshalb eine besonders sensitive Virusnachweismethode.
Anlässlich von KSPV-Infektionsversuchen an Hausschweinen wurden diverse Organe inklusive Muskulatur von mit verschiedenen KSPV-Stämmen infizierten Tieren mit Hilfe von Zellkultur, Immunhistologie und RT-PCR auf KSPV untersucht. Bei der Probenaufbereitung für die RT-PCR wurden verschiedene Virusanreicherungs-methoden getestet. Die Resultate des Virusnachweises in der Muskulatur wurden mit dem Virusnachweis in anderen Organen und im Blut verglichen.PT-PCR war die empfindlichste Methode zum KSPV-Nachweis im Muskelfleisch. Eine vorgängige RNA-Anreicherung ist bei Muskelproben unerlässlich; gute Erfahrungen wurden mit einer Trizol®-Extraktion gemacht. Allerdings waren nur 58% der Muskelproben von den in Zielorganen positiven Schweinen mittels RT-PCR und nur 40% mittels Zellkultur positiv. Der Virusnachweis in der Muskulatur war vor allem bei klinisch erkrankten, mit hochvirulenten KSPV-Stämmen infizierten Schweinen positiv. Der KSPV-Nachweis im Muskelfleisch scheint unzuverlässig zu sein, wenn Proben von klinisch nicht schwer erkrankten Tieren untersucht werden.
2. Aufbau eines Referenzzentrums für Newcastle Disease (ND)
In der Schweiz traten in den letzten Jahren sporadisch Fälle von Atypischer Geflügelpest (Newcastle Disease (ND)) auf. Die ND-Diagnostik am IVI soll ausgebaut und auf zuverlässigen, zeitgerechten Methoden basieren, die zum Teil aus Kostengründen in den privaten und kantonalen Laboratorien nicht durchgeführt werden können. Es soll eine Diagnostik etabliert werden, mit der es möglich ist, statt mittels Tierversuchen (Bestimmung des Pathogenitätsindex in Küken) mittels einer schnellen molekularbiologischen Analyse ein ND-Virusisolat zu charakterisieren. Als Referenzlabor hat das IVI zudem Ringversuche in privaten und kantonalen Laboratorien zu organisieren.Es wurde ein zuverlässiger ND-Virusnachweis aus Organen mittels RT-PCR etabliert. Mit Hilfe eines Tierversuches wurde abgeklärt (i) zu welchem Zeitpunkt und (ii) in welchen Organen das ND-Virus (NDV) am besten mit der RT-PCR nachgewiesen werden kann. Die Resultate wurden mit der Referenzmethode, dem Virusnachweis auf Hühnerembryonen sowie mit dem Nachweis in Zellkulturen verglichen. Viren wurden im F1/F2 Genombereich des Fusionsproteins sequenziert, um Aussagen über ihre Pathogenität machen zu können. Für serologische Untersuchungen wurden verschiedene kommerziell erhältliche ELISA's untereinander und mit dem Referenztest, dem Hämagglutinationshemmtest (HAH) verglichen. Mit vom Tierversuch und von Schweizer Seuchenausbrüchen gewonnenen Seren wurde ein Ringversuch in den ND-Diagnostiklabors der Schweiz durchgeführt. Dieser wurde in enger Zusammenarbeit mit dem O.I.E. Referenzlabor CVL Weybridge und der BFA, Insel Riems durchgeführt.Die verwendete RT-PCR ist für den schnellen NDV-Nachweis in Organen geeignet, scheint aber in ihrer Empfindlichkeit nicht in allen Fällen an den Virusnachweis auf Hühnerembryonen heranzukommen, infizierte Tiere werden aber zuverlässig erfasst. Die RT-PCR bietet eine Grundlage zur Sequenzierung der Virusisolate. Der Virusnachweis auf Zellkulturen ist etabliert, er eignet sich gut, um NDV in Allantoisflüssigkeit nachzuweisen, dies als Alternative zum Nachweis mittels Hämagglutination. Diverse kommerziell erhältliche ELISA's sind ebenso zuverlässig für den ND-Antikörpernachweis zu verwenden, wie der HAH, dies zeigen auch die Resultate aus den durchgeführten Ringtests.
3.Verbesserung der Newcastle Disease-Diagnostik und seroepidemiologische Untersuchungen bei Legehennen
Im Rahmen des Aufbaus eines Referenzzentrums für atypische Geflügelpest (= Newcastle Disease, ND) sollte speziell der ND-Virusnachweis mittels RT-PCR weiterentwickelt werden. Die RT-PCR mit Organmaterial und falls möglich mit Kotproben sollte mit Hilfe eines Tierversuches an Hühnern etabliert werden. Eine ND-Diagnostik mit Kotproben ist insofern von Bedeutung, da diese Proben auch bei Wildvögeln zu erheben sind. Weiter wurde abgeklärt, wie hoch die ND-Seroprävalenz beim Nutzgeflügel in der Schweiz ist, um so eine Aussage über den ND-Seuchenstatus machen zu können.Für die Etablierung der RT-PCR an Organmaterial wurden Küken, welche mit ND-Impfstoffen geimpft wurden, euthanasiert und die wichtigsten Organe mit mehreren Methoden für den Virusnachweis aufgearbeitet. Danach wurden Hühner im Rahmen eines Tierversuches mit dem ND-Feldisolat aus Safnern infiziert und das ND-Virus (NDV) in den Organen und im Kot mittels RT-PCR nachgewiesen. Wir erhielten so Aufschluss darüber, (i) zu welchem Zeitpunkt nach der Infektion und (ii) in welchen Organen das NDV nachzuweisen ist.
Für die seroepidemiologischen Untersuchungen beim Nutzgeflügel wurden im Geflügelschlachthof der SEG in Zell je 30 Blutproben von 260 Legehennenherden aus der ganzen Schweiz gesammelt und mit einem ND-Blocking-ELISA auf Antikörper gegen NDV untersucht. Die Resulate wurden mit einem neu entwickelten Computer Simulations Modell auf Herdenbasis statistisch ausgewertet. Die Untersuchungen ergaben das die Schweiz nicht NDV-frei ist.
Mittels RT-PCR ist es möglich aus Organen, sowohl in mit ND-Impfvirus, als auch in mit Feldvirus infizierten Tieren das NDV zuverlässig nachzuweisen, die Sensitivität der RT-PCR, verglichen mit der herkömmlichen Virusisolation auf Hühnerembryonen war höher, insbesondere bei Tieren, die bereits Antikörper gegen das NDV gebildet hatten. Das Virus konnte vor allem im Magen-Darm- und Atmungstrakt, sowie in Nieren und Konjunktiven nachgewiesen werden. Positive Resultate liegen auch von Kotproben vor.
Da die Resultate einer RT-PCR bereits innerhalb eines Arbeitstages verfügbar sind, ist diese Diagnostikmethode sehr geeignet, um bei Verdachtsfällen schnell einen ersten Befund zu liefern. Ausserdem besteht die Möglichkeit, die amplifizierte DNA weiter zu charakterisieren, um Rückschlüsse auf die Pathogenität des Virus zu erhalten.
In der seroepidemiologischen Studie wurden 256 der 260 mit dem ELISA getesteten Herden als NDV-Antikörper negativ beurteilt. Vier Herden waren positiv, ohne hingegen je ND-typische Symptome gezeigt zu haben, das bedeutet, dass diese Infektionen durch lentogene d.h. wenig krankmachende NDV oder durch Impfviren verursacht wurden.
Publikationen / Ergebnisse
(Deutsch)
Gohm, D. (1998): Serological testing and simulation modelling: A survey of Newcastle Disease in Swiss laying hen flocks. Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktortitels der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Bern..
Publikationen / Ergebnisse
(Englisch)
Thür, B., Hofmann, M.A. (1998): Comparative detection of classical swine fever virus in striated muscles from experimentally infected pigs by reverse transcription polymerase chain reaction, cell culture isolation and immunhistochemistry. Journal of Virological Methods, in press.

Thür, B., Gohm, D., Hofmann, M.A. (1997): Newcastle disease antibody detection by ELISA: comparison of three different ELISAs with haemagglutination inhibition test. Poster, 4th international congress of veterinary virology, 24-27 August 1997, Edinburgh.


Gohm, D., Thür, B., Audigé, L. , Hoffmann, M.A. (1998): Survey of Newcastle Disease in Swiss Laying-hen flocks using Stochastic Modelling. Preventive Veterinary Medicine, accepted
URL-Adressen
(Deutsch)