Schlüsselwörter
(Deutsch)
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Pestivirus, KSP, rekombinantes Virus, defekte Viruspartikel, Impfstoff, attenuiert, Markerimpfstoff, orale Immunisierung, Verpackungssystem
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Kurzbeschreibung
(Deutsch)
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Als Modell für die Entwicklung von nicht transmissiblen attenuierten Pestivirus Impfstoffen sollen sog. Replikon Partikel (RP) des Virus der Klassischen Schweinepest (KSPV) hergestellt werden. Diese Viruspartikel enthalten subgenomische RNA mit Deletionen in mindestens einem der Gene, die für die viralen Hüllproteine kodieren. Weil damit ein Teil der genetischen Information für die Synthese der Virushülle fehlt, ist die Infektion von Zellen mit solchen Partikeln abortiv, d.h. es werden keine neuen Virionen gebildet. Hingegen erfolgt in der Zelle sowohl Replikation der subgenomischen RNA (= Replikon) als auch Expression der darauf kodierten viralen Proteine. Um die subgenomische RNA in Partikel zu verpacken werden Zelllinien verwendet, welche die fehlenden viralen Hüllproteine konstitutiv exprimieren. Wir konnten zeigen, dass KSPV-RP mit unterschiedlichen Deletionen im Gen, das für das Hüllprotein E2 kodiert, Schweine nach einmaliger oraler Immunisierung weitgehend vor KSP schützen. In der Fortsetzung dieses Projektes sollen Erns Deletionsmutanten etabliert und geprüft werden. Ebenso sehen wir vor, KSPV-RP zu konstruieren, die zusätzlich einen positiven Marker zur Unterscheidung zwischen immunisierten und infizierten Tieren enthalten. Im weiteren wird mit diesen Konstrukten die Expression des E2 Proteins an der Oberfläche der infizierten Zellen angestrebt. Damit soll eine effizientere Induktion der Immunantwort und folglich ein besserer Schutz erreicht werden.
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Projektziele
(Deutsch)
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Für die Fortsetzung des Projektes haben wir die Ziele aufgrund der bisher gewonnenen Erkenntnisse angepasst. Nachdem die ersten zwei Impfversuchen mit KSPV-RP erfolgversprechende Resultate ergaben, wollen wir die oronasale Immunisierung weiter charakterisieren und die Impfstoffe verbessern. Hingegen werden wir die intramuskuläre und die intradermale Immunisierung mit KSPV-RP vorerst nicht weiter verfolgen, obwohl letztere einen guten Impfschutz bewirkt. Die intradermale Applikation stellt jedoch keine praxistaugliche Methode für die Immunisierung von Schweinen dar.
Eine Frage, die sich zunächst stellt, ist jene nach der erforderlichen Dosis, um einen Impfschutz nach oronasaler Immunisierung zu erhalten. Wir werden diese Frage noch im laufenden Projekt in einem weiteren Tierversuch, unter Verwendung der bereits vorhandenen KSPV-RP, klären.
In der beantragten Fortsetzung des Projektes möchten wir die mit den Prototyp KSPV-RP gewonnen Erkenntnisse nutzen, um noch effizientere Impfstoffe zu entwickeln. Dabei geht es darum, weitere Typen von KSPV-RP herzustellen, aber auch deren Wirkungsmechanismen zu charakterisieren. Da für einen effizienten Schutz gegen Infektion mit KSPV die mucosale Immunität entscheidend sein dürfte, soll geklärt werden, ob und in welchem Mass die Vermutung zutrifft, dass dazu die Expression von Erns, und möglicherweise nicht jene von E2, erforderlich ist. Ein weiteres Ziel besteht darin, die generelle Immunogenität der KSPV-RP Vakzinen zu verbessern indem immunogene Epitope für B-Lymphozyten und T-Lymphozyten optimal kombiniert werden. Wir wollen deshalb klären, welchen Einfluss die Expression von E2 oder Erns im Replikon auf die zelluläre und humorale Immunantwort ausübt.
Eine effizientere humorale Immunantwort soll insbesondere dadurch erzielt werden, dass E2 an der Oberfläche der Zellen, die mit KSPV-RP infiziert werden, exprimiert wird. Es ist verschiedentlich gezeigt worden, dass Antigene, die an der Zelloberfläche exprimiert werden, eine stärkere humorale Immunantwort induzieren, als solche, die intrazellulär exprimiert oder sekretiert werden (4,26). Natürlicherweise wird das E2 Protein von Viren der Familie Flaviviridae, zu denen die Pestiviren gehören, in infizierten Zellen nicht an die Oberfläche transportiert, sondern verbleibt im endoplasmatischen Retikulum (23). Die Expression an der Zelloberfläche kann durch Fusion des E2 Proteins an eine entsprechende Sequenzen, welche das Protein an der Zelloberfläche befördern und in die Plasmamembran verankern, bewirkt werden (3,9).
Die Einführung eines positiven Markers in die KSPV-RP Vakzine ist ebenfalls vorgesehen. Wir sehen vor, das bereits oben erwähnte Markerprotein GFP als Prototyp zu verwenden, um damit grundsätzlich das Prinzip der Koexpression eines Markers auf dem entsprechenden Replikon zu evaluieren. Schliesslich soll die Effizienz der mucosalen Immunisierung durch Verwendung von Adjuvanzien verbessert werden.
Das Ziel des gesamten Projektes besteht darin, eine Vakzine zu etablieren, die oral verabreicht werden kann und so effizient ist, dass sie bereits nach einmaliger Applikation zu einer sterilen Immunität führt, d.h. Schutz vor Infektion und Krankheit und Verhinderung von Virusausscheidung. Inwieweit dieses hochgesteckte Ziel erreicht werden kann, wird sich im Verlaufe der vorgesehenen Arbeiten zeigen müssen.
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Publikationen / Ergebnisse
(Englisch)
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Frey, C.F., Bauhofer, O., Ruggli, N., Summerfield, A., Hofmann, M.A., Tratschin, J.D., 2006. Classical swine fever virus replicon particles lacking the Erns gene: a potential marker vaccine for intradermal vaccination. Vet. Res. 37 (2006) 655-670.
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