Kurzbeschreibung
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Bei einem Ausbruch von Anaplasmose in einem Rinderbestand im August 2002 im Kanton Graubünden, in dessen Folge 300 Kühe getötet werden musste, wurden auch Infektionen mit Blutparasiten festgestellt. Mit einer ersten molekularbiologischen Analyse liessen sich Theileria buffeli und Babesia bigemina identifizieren, beides Erreger, die noch nie zuvor in der Schweiz nachgewiesen worden waren. Der Beitrag dieser Erreger für die Erkrankung im Bestand ist unklar; T. buffeli gilt als wenig pathogen, von B. bigemina sind Stämme mit unterschiedlicher Virulenz beschrieben. Ziel dieses Projektes ist es einerseits, das methodische Repertoire (Immunologie, Molekularbiologie) für die Diagnose dieser neuen Parasiten als akkreditierte Test zu etablie-ren. Zum anderen sollen diese Erreger weiter genetisch charakterisiert werden und mit ausländischen Isola-ten verglichen werden. Ferner soll das Vorkommen dieser Parasiten in der Schweiz in weiteren Rinderbe-ständen, aber auch in den potentiellen Überträgerzecken sowie in Wildtieren erforscht werden.
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Projektziele
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VORBEMERKUNG: Dieses Projekt soll durch regelmässige Laborsitzungen mit der Gruppe von Prof. H. Lutz eng koordiniert werden, um Synergien optimal zu nutzen (dieses Vorgehen wird nicht bei jedem Punkt wiederholt aufgeführt).
1) Verbreitung von Babesia- und Theileria spp. in verschiedenen Gebieten der Schweiz
Vorgehen: Retrospektiv soll bereits bestehendes Material (Serumbank, Zecken) untersucht werden. Je nach Ausgangsmaterial werden serologische (kommerziell erhältlicher B. divergens IFAT, Labor Böse, Hildesheim, Deutschland; B. bigemina-Serologie gemäss Erkenntnissen aus Subprojekt 3) oder molekulare Methoden eingesetzt (PCR; Babesien und Theilerien. Die in den ersten Untersuchungen eingesetzten PCR für den Nachweis von Blutprotozoen [Primer-Design für Nachweis von Theileria spp.: Dr. Meli, Veterinärmedizinisches Institut; für Nachweis von bovinen Babesien: IPZ] sollen akkreditiert werden und somit für zukünftige infektiologische Abklärungen bereit stehen). Prospektiv werden Betriebe (Sentinellbetriebe: Auswahl und Planung mit Dr. K. Stärk, BVET, und in Anlehnung an die Anaplasmose-Dissertation, Projekt Prof. Lutz) in ausgewählten Gegenden der Schweiz (Tessin, Südbünden, Nordbünden, Mittelland, Berner-Oberland, Wallis, Jura, inklusive Gegenden, aus denen B. divergens in der Vergangenheit beschrieben wurde) untersucht. Im weiteren sollen Proben von Wildtieren für PCR-Analysen organisiert werden, dies um das Reservoir-Potential von Wildtieren für diese Parasiten zu bestimmen.
Ausgangsmaterial:
a) Blutproben von Rindern (Serum, DNA)
b) Gewebe (Milz) oder Blutkoagulat von Fallwild (Zusammenarbeit mit Pathologie Bern, Galli-Valerio, Jagdinspektorate Graubünden, Tessin, Westschweiz (Genf).
c) Bereits vorhandene DNA, isoliert aus Zecken. Zusammenarbeit mit Gruppe Lutz (Veterinärmedizinisches Labor, Uni Zürich; vorhanden sind 600 DNA Isolationen von jeweils 10 Zecken aus der ganzen Schweiz), Dr. M. Bernasconi (Zoologisches Institut, Uni Zürich), Prof. B. Betschart, Dr. L. Gern (Zoologisches Institut, Uni Neuenburg).
d) Zecken, die im Subprojekt 4 gesammelt werden
2) Vollständige molekulare Charakterisierung der Babesien (B. bigemina, B. divergens) und Vergleich mit Reverenz- und Feldisolaten aus dem Ausland
Unsere ersten genetischen Analysen haben die Parasiten aus Chur anhand der Sequenzübereinstimmung in einer konservierten Region als zu B. bigemina zugehörend identifiziert. Diese Parasiten wie auch die in Subprojekt 1 identifizierten B. divergens sollen auf bekannten variablen genetischen Loci (Fisher et al., 2001; Gubbels et al., 1999) und auf neu zu bestimmenden (rDNA ITS, Plastid DNA; (Lang-Unnasch et al., 1998) weiter typisiert werden. Die erhaltenen Sequenzen werden mit entsprechenden, noch zu eruierenden Sequenzen von Isolaten aus Italien (Dr. G. Savini, Istituto Zooprofilattico Sperimentale, Teramo, Italien) und aus weiteren Endemiegebieten Europas, den USA und Australien verglichen werden. Es soll für jede Parasiten-Art ein informativer genetischer Locus identifiziert werden und für weitergehende Untersuchungen (Genotypisierung der Parasiten aus Zecken und Wildtieren, siehe Subprojekte 1 und 4) verwendet werden.
3) Retrospektive Analysen im Bestand Mehli - eng verflochten mit dem ersteingereichten Projekt (Projekt Lutz)
Mit diesen zusätzlichen Analysen sollen die epidemiologischen Zusammenhänge im besagten Bestand bezüglich Protozoen erhärtet werden. Auch wenn Anaplasmen und die nachgewiesenen Protozoen (B. bigemina, T. buffeli) durch gemeinsame Vektoren übertragen werden können, bestehen anderseits auch grosse Unterschiede in der Übertragung (Tabelle 1). Es wird äusserst schwierig festzustellen sein, ob die Infektionen mit Blut-Protozoen bereits vorher bestanden und eventuell nur durch die Anaplasmose reaktiviert wurden oder ob sie gleichzeitig im Bestand eingeschleppt wurden.
Vorgehen: Der ganze Bestand wie auch Kontrollbetriebe und Kontaktbetriebe (Serumbank verwaltet von der Guppe Lutz) werden mit einem B. bigemina-IFAT und einem spezifischeren ELISA (DPI, Queensland, Australien) untersucht (Validierung dieser serologischen Testverfahren für den Nachweis wird finanziell unabhängig durch unser Institut durchgeführt werden; die serologischen Tests sollen in unserem Labor akkreditiert werden). Diese Daten werden gemeinsam mit dem übrigen Datensatz des Betriebes epidemiologisch ausgewertet (Gruppe Lutz und BVET). In einer repräsentativen Gruppe wird zusätzlich die Babesia-PCR durchgeführt (DNA bereits im Labor Lutz isoliert). Serologie und Erregernachweis (Morphologie und PCR) sollen verglichen und auf den klinischen Aussagewert geprüft werden.
4) Untersuchung von Zeckenvorkommen in verschiedenen Gebieten der Schweiz
Eine systematische Zeckenerhebung in ausgewählten Gebieten der Schweiz soll für mindestens zwei Jahre organisiert werden (Zusammenarbeit mit Zoologischen Instituten Unis Zürich und Neuenburg).
Sammelstrategien:
Regelmässiger Besuch von Weiderindern auf ausgewählten Betrieben durch DoktorandIn zu verschiedenen Jahreszeiten und in verschiedenen Höhenlagen (Heimweiden, Maiensässe, Alp).
Anschreiben von TierärztInnen in ausgewählten Gegenden (Zecken von Schaf, Pferd, Rind, Ziege, Hund, Katze).
Zecken von Fallwild: Zusammenarbeit mit Pathologie Bern, Galli-Valerio, Jagdinspektorate (Graubünden, Tessin, Westschweiz (Genf).
Gezielte Nagerfangaktionen in ausgewählten Gebieten (je nach Zeckenart und Gegend muss der optimale Zeitpunkt gewählt werden, Zusammenarbeit mit Zoologischem Institut, Uni Neuenburg).
Die Zecken sollen morphologisch bestimmt werden (Zusammenarbeit mit Zoologischem Institut, Uni Neuenburg) und nach einheitlichem Protokoll für molekulare Untersuchungen aufgearbeitet werden. DNA aus diesen Zecken steht allen beteiligten Gruppen zur Verfügung [Prokaryoten: Gruppe Prof. Lutz, Eukaryoten (Babesien, Theilerien): IPZ, Zecken-Typisierung: Dr. Bernasconi, Zoologisches Institut Uni Zürich]. Dieser Projektteil trägt auch dazu bei, die Verbreitung der diversen Zeckenarten in der Schweiz zu dokumentieren und eventuelle Veränderungen der Verbreitung längerfristig verfolgen zu können.
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Abstract
(Deutsch)
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Diagnose und molekulare Charakterisierung: Der IFAT zeigte eine gute Sensitivität (73%), doch lässt er keine Art-spezifische Diagnose zu. Kreuzreaktionen wurden zudem beobachtet mit Seren von Anaplasma-infizierten Rindern, nicht jedoch mit solchen mit Fasziola-Infektionen. IFAT ist somit geeignet, um eine Rinder-Population auf Antikörper gegen B. divergens zu überprüfen. Der Test wurde zur Akkreditierung im Jahre 2007 eingereicht (Diagnostikzentrum des Institutes für Parasitologie, Universität Zürich).
Es wurden PCRs mit Primern mit der 18S rRNA als Zielsequenz entwickelt, womit die verschiedenen Babesia-Arten/Genotypen entweder direkt oder nach Sequenzierung nachgewiesen werden können. Die genetischen Analysen von B. bigemina zeigten, dass das Isolat aus der Schweiz am nächsten mit einem Spanischen Isolat verwandt (aber nicht identisch) ist und nicht, wie erwartet, mit dem Isolat aus Mittelitalien. Mit diesen molekularbiologische Untersuchungen können keine klaren Aussagen über die Herkunft des B. bigemina Isolats aus Chur gemacht werden, und der Weg der Einschleppung bleibt unklar.
Zeckenstudie Südschweiz: Die Identifikation von über 2000 Zecken, welche von Wiederkäuern gesammelt wurden, bestätigte, dass nebst der in der Schweiz weitverbreiteten Zecke Ixodes ricinus auch selten andere Arten zu finden sind, wie Dermacentor marginatus und Haemaphysalis punctata.
Die Zecken wurden anschließend mit PCR/Sequenzieren auf Babesien-DNA überprüft. In I. ricinus Weibchen, welche von Schafen und Ziegen abgelesen wurden, konnte zweimal Babesia sp. EU1, ein zoonotischer Genotyp, und einmal B. divergens nachgewiesen werden. Die Vielfalt von Babesien-Arten in Zecken vom Wild war überraschend: B. divergens in 6, Babesia sp. EU1 in 12, B. major in 2 und ein vierter Babesien-Genotyp (Babesia sp. CH1) in 4 Zeckenproben. Letzterer ist gemäss Sequenzanalysen am nächsten mit B. odocoilei (einer Babesienart aus Hirsch in Nordamerika) verwandt. Weiter gibt diese Studie über die Verbreitung von bovinen Babesien und deren Vektoren keinen Hinweis auf eine Etablierung von B. bigemina in der Schweiz: In keinem der klinischen Fälle bei Rindern, die untersucht wurden (n=11), wurde eine grosse Babesien-Art als Ursache identifiziert. Zudem gilt keine der gesammelten Zeckenarten als Vektor für B. bigemina und diese Art wurde in Zecken nicht nachgewiesen.
Epidemiologie Tössstock: Von 312 Rindern von Dauer- und Alpbetrieben des Tössstock-Gebietes wurden z.T. mehrere Blutproben mittels IFAT und PCR auf Babesien untersucht, wobei keine Infektionen diagnostiziert werden konnten. Ebenso ergaben Befragungen von Bauern und Tierärzten der Region keine Hinweise auf klinische Erkrankungen bei Rindern. Hingegen waren in Zecken (n=887), welche von solchen Rindern gesammelt wurden, Babesia sp. EU1 (n=5) und in einem Falle B. divergens nachweisbar. Die B. divergens-ähnlichen Isolate aus Gämsen vom Tössstock werden weiter genetisch analysiert werden und mit Isolaten aus Rindern verglichen um abzuklären, ob eine Übertragung von Wildwiederkäuern auf Rinder und umgekehrt möglich ist oder ob es sich um zwei unterschiedliche parasitische Organismen handelt.
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Publikationen / Ergebnisse
(Englisch)
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Hilpertshauser, H. P.; Deplazes, M.; Schnyder, L.; Gern, A.; Mathis. (2006): Babesia spp. identified by PCR in ticks collected from domestic and wild ruminants in southern Switzerland. Appl. Environ. Microbiol. 72:6503-6507.
Hilpertshauser, H., Deplazes, P.; Meli, M.L.; Hofmann-Lehmann, R.; Lutz, H.; Mathis, A. (2007): Genotyping of Babesia bigemina from cattle from a non-endemic area (Switzerland). Vet. Parasitol. (in press).
Hilpertshauser, H., P.; Deplazes, A.; Mathis: “Genotyping of Babesia bigemina from an unexpected outbreak in a cattle herd in Switzerland and preliminary survey of bovine babesiosis in Switzerland”. (Posters)
- 5th Int. Conf. Ticks and Tick-borne Pathogens; Neuchâtel, 28.8.-2.9. 2005.
- Jahrestagung Schweiz. Ges. Tropenmed. Parasitol., Monte Verità, 3.-4. 11. 2005
Hoby, S.; Robert, N.; Meli, M.; Mathis, A.; Deplazes, P.; Lutz, H.; Schmid, N.; and Ryser, M.-P.: „Fatal Babesia divergens infection in free-ranging chamois (Rupicapra r. rupicapra) in Switzerland“. VII Conf. Europ. Wildl. Dis. Assoc., Aosta Valley (Italy), September 27-30, 2006. (Poster)
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