Mots-clé
(Allemand)
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A. marginale, Babesia,
Theileria, M.wenyonii, anemia, PCR, hematology, hematocrit,
inclusion bodies, microscopy, ticks, transmission.
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Description succincte
(Allemand)
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Im August 2002 ist in
einem Rinderbestand im Kanton Graubünden eine schwerer Fall
von Anaplasmose aufgetreten, in dessen Folge gegen 300 Kühe
getötet werden mussten. Neben A. marginale wurden in den
erkrankten Kühen Vertreter von Babesia spp., Theileria spp.
und M. wenyonii nachgewiesen. Da bislang unklar ist, ob und in welchem Ausmass A. marginale und die andern
Erreger in der Schweiz vorkommen, hat das vorliegende Projekt zum
Ziel, das Vorkommen von A. marginale und der andern Erreger in der
Schweiz abzuklären. Zu diesem Zweck sollen
die Kühe in der Umgebung des Betriebs, wo der Anaplasmosefall
auftrat, im Kanton Graubünden und in der übrigen Schweiz
bezüglich des Vorkommens der A. marginale-Infektion
serologisch untersucht werden. Ferner soll ein
Western Blot Verfahren etabliert werden, mit dem im ELISA
positive und fraglich-positive Proben
bestätigt werden können. Weitere Ziele des Projektes sind
die experimentelle Reaktivierung von A.marginale in seropositiven
Kühen durch Splenektomie, der Vergleich der bei uns
nachgewiesenen Isolate mit jenen des Auslandes durch
Nukleotidsequenzvergleich sowie die Durchführung einer
Uebersichtsuntersuchung über das Vorkommen der
genannten Erreger in Zecken. Das hier vorliegende Gesuch
ist das erste von 2 Teilprojekten zu diesem
Thema. Der 2. Teil wird in den ersten Monaten des Jahres 2003 dem
BVET eingereicht.
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Objectifs du projet
(Allemand)
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Ziel dieses Subprojekts
ist die Abklärung, ob und falls ja mit welcher Häufigkeit
die A. marginale Infektion in der Umgebung des Betriebs Mehli, dem
Kt. Graubünden und in der übrigen Schweiz vorkommt.
Ferner soll dieses Subprojekt die Grundlage liefern zur
Abklärung, welche Rolle allenfalls den andern bei den
Kühen des Herrn Mehli nachgewiesenen Erregern zukommt oder ob
es sich beim Fall Mehli um ein aus dem Ausland importiertes
Geschehen handelte . Bisher wurden nur einzelne
Krankheits-fälle in der Schweiz
beschrieben, und es stellt sich die Frage, ob mehr dahintersteckt
als bisher angenommen. Mit diesem Subprojekt soll die Grundlage geschaffen wer-den, die es den Gesetzgebern und
Tierärzten erlaubt, Entscheidungen über Strategi-en und
Ausmasse adäquater Bekämpfungsmassnahmen zu treffen,
sowie Überwa-chungsprogramme zu konzipieren.
Um
über die A. marginale Situation Klarheit zu gewinnen, sollen
sowohl Proben der Betriebe der Region Chur und Puschlav (von wo im
Juli 2002 rund 15 Tiere in den Betrieb Mehli überführt
worden waren) sowie repräsentative Stichproben der Betriebe
des Kantons Graubünden, und von Betrieben der übrigen
Schweiz bezüglich Anti-körper gegen A. marginale
untersucht werden. Um einen Überblick auch
in zeitlicher Hinsicht zu erhalten, sollen in einem ersten Schritt
Proben aus dem Jahr 1998 und daraufhin Proben der aktuellen Zeit
getestet werden. Dies kann anhand der beste-henden Serumbank und
von im Jahre 2003 zu entnehmenden Blutproben mit dem kompetitiven
ELISA-Test bestimmt werden.
Zur
Berechnung des Stichprobenumfanges sind folgende Annahmen zu
treffen:
- die Zahl
der adulten Kühe in der Schweiz: 715 000
- die
Parameter des Tests: angenommene diagnostische Sensitivität
96%,
angenommene Spezifität 95%
- die
Fehler erster und zweiter Ordnung: a=5%, ß=20%
- der
Prävalenzbereich, für den die Stichprobengrösse
aussagekräftig ist.
Im
vorliegenden Fall wird eine Seroprävalenz zwischen 5 und 20 %
erwartet; es müssen daher mindestens 213 Proben von
Graubünden und ebenso viele der Be-triebe der restlichen
Schweiz untersucht werden. Bei bis zu 13 positiven Proben wäre
noch davon auszugehen, dass die Seroprävalenz unter 5 % liegt.
Um niedrigere Prä-valenzen erkennen zu können,
müsste man den Stichprobenumfang entsprechend
vergrössern.
Die
Ergebnisse dieser Untersuchung sollen mit Hilfe spezieller Software
auf der Landkarte der Schweiz grafisch dargestellt
werden.
Subprojekt 2
In den
bisherigen ELISA Untersuchungen zeigte sich, dass gegen 50% der
Kühe des Bestandes Mehli und zwischen 1.4 und 4.8% der aus
verschiedenen Gegenden der Schweiz, von gesunden Kühen
stammenden Proben für A. marginale seropositiv sind. Die
positiven Resultate im Bestand Mehli sind
zweifellos korrekt positiv, da bei diesen Tieren ja der Erreger
sowohl mikroskopisch als auch mittels PCR
nachgewie-sen wurde. Bei den von gesunden Kühen gewonnenen
Proben ist die Aussagekraft der positiven Resultate weniger klar,
da sich der Anteil der positiven Proben in der Grössenordnung
der diagnostische Spezifität (96%) bewegt. Hier liegt also
eine typi-sche Problemstellung des prädiktiven Wertes eines
positiven Resultates bei geringer Prävalenz vor (Lutz and
Winkler, 1995). Um abzuklären, ob es sich hier um korrekt oder
falsch positive Proben handelt, erscheint es dringend notwendig,
die im ELISA positiven sowie fraglich-positiven
Proben mit einer zweiten, auf einem andern Prinzip basierenden
Methode zu untersuchen. In vorliegenden Fall erscheint uns der
We-stern Blot als sehr geeignet, da dieses Verfahren
hochempfindlich ist und die Erken-nung von
Antikörpern erlaubt, die spezifisch gegen die wichtigen
Komponenten von A. marginale gerichtet sind. Unser Labor
verfügt seit mehr als 20 Jahren über Erfah-rung mit der
Charakterisierung von Antikörpern gegen komplexe
Antigenmischungen mittels GEDELISA und Western Blot ((Lutz et al.,
1979; Lutz H., 1987), weshalb wir meinen, dass mittels Western Blot
die Spezifität der Anitikörper dieser Rinderproben
charakterisiert werden kann. Wir haben von Dr. K.Kocan, die
über grosse Erfahrung mit der Züchtung von A. marginale
in Zeckenzellkulturen verfügt (Kocan et al., 1996; Blouin et
al., 1998; Blouin et al., 2002; Bowie et al., 2002), mit A.
marginale infizierte Kulturen sowie nicht infizierte Kontrollen
erhalten, die kürzlich in einem Western Blot eingesetzt werden
konnten. In Abb. 1 sind die Resultate des
ersten, am 20.12. fertig-gestellten Western Blots dargestellt. Es
wird deutlich, dass im Serum einer im cELI-SA
positiven Kuh aus dem Betrieb Mehli, Antikörper vorhanden
sind, die antigene Banden mit einem Molekulargewicht in der
Grössenordnung von 90'000, 50'000 und 25'000 Dalton erkennen.
Dies entspricht ziemlich genau dem Bandenmuster, wel-ches bei A.
marginale Isolaten aus Florida und Illinois gefunden wurde (Adams,
Smith, and Kuhlenschmidt, 1986). Wir sind überzeugt, dass es
uns gelingen wird, mittels des Western Blot Verfahrens und den uns
bereits zur Verfügung stehenden Antigen, die im cELISA
fraglich positiven und positiven Proben bezüglich der
Richtig-keit des ELISA Resultates zu bestätigen. Es ist
vorgesehen, dass sämtliche im ELI-SA fraglich positiven und
positiven Resultate der gesunden Kühe mit diesem We-stern Blot
untersucht werden. Es dürfte sich dabei um
etwa 100 Seren handeln. Von Mitarbeitern des BVET wurde
vorgeschlagen, dass einzelne Proben an ein externes Labor zur
Bestätigung geschickt werden sollen. Dem
stehen wir grundsätzlich positiv gegenüber, vertreten
aber die Meinung, dass dies lediglich zur Qualitätskontrolle
ge-schehen sollte. Da anzunehmen ist, dass die Anaplasmose auch in
Zukunft korrekt diagnostiziert werden muss, sollten wir in der
Schweiz unbedingt über das know-how zur Durchführung und
Beurteilung eines Western Blots selbst verfügen.
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Publications / Résultats
(Anglais)
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Dreher, U.M., Hofmann-Lehmann, R., Meli, M.L., Regula, G., Cagienard, A.Y., Stärk, K.D.C., Doherr, M.G., Filli, F., Hässig, M., Braun, U., Kocan K.M., Lutz H. (2005) Seroprevalence of anaplasmosis among cattle in Switzerland in 1998 and 2003: No evidence of an emerging disease. Veterinary Microbiology 107, p. 71-79
Dreher, U.M., de la Fuente, J., Hofmann-Lehmann, R., Meli, M.L., Pusterla, N., Kocan, K.M., Woldehiwet, Z., Braun, U., Regula, G., Staerk, K.D.C., Lutz, H. (2005): Serologic Cross-Reactivity between Anaplasma marginale and Anaplasma phagocytophilum. Clinical and Diagnostical Laboratory Immunology, Vol. 12, No. 10, p. 1177-1183
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