Schlüsselwörter
(Deutsch)
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Borna Disease-Virus, BDV, Borna Disease, BD, RT-PCR, Real Time PCR, TaqMan, Immunhistologie
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Kurzbeschreibung
(Deutsch)
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Zum Nachweis von Borna Disease Virus (BDV)-RNA soll ein Real Time PCR-Verfahren (TaqMan®) für die Hauptproteine p24 (P-Protein) und p40 (N-Protein) codierenden Genabschnitte etabliert werden. Damit würde ein Tool für epidemiologische Untersuchungen verfügbar, welches zur Erkennung von Virusträgern und damit von potentiellen Ansteckungsquellen für andere Tiere und möglicherweise Menschen dienen könnte. Hauptvorteile dieser Methode sind die geringe Kontaminationsgefahr (geschlossenes System) und der hohe Automatisierungsgrad, der die Untersuchung von grossen Zahlen an Proben ermöglicht.
Die verfügbaren immunhistologischen Methoden sind sehr wahrscheinlich nicht sensitiv genug und daher nicht geeignet, um inapparent infizierte Tiere (ohne Symptome) zu erkennen. Die bisherigen Versuche, mit Hilfe von Serologie, Immunhistologie und RT-PCR inapparent infizierten Tiere zu identifizieren, sind zumindest bei uns fehlgeschlagen. Die RT-PCR, v.a. die nested RT-PCR, erwies sich als sehr anfällig gegenüber Kontaminationen. Der Hauptgrund für die ausserordentlich grossen und vielfältigen Meinungsverschiedenheiten bezüglich Wirtsspektrum und Pathogenität von Bornaviren scheint auf solchen Kontaminationsproblemen zu beruhen (Uebersicht bei Stäheli et al 2000).
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Kurzbeschreibung
(Englisch)
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The aim of this study is the development and evaluation of a novel Real Time RT-PCR (TaqMan®) assay for the detection of Borna disease Virus RNA, in particular for the RNA sequences coding for p24 (P-protein) and p40 (N-protein). We expect this method to become an important analytical tool for epidemiological studies, especially for the diagnosis of clinically inapparent BDV infections in domestic and wild living animals, as well as in humans. These inapparently infected animals are potential virus carriers and infection source. The advantage of the Real Time PCR-methods in comparison with other PCR-techniques is the lower contamination risk and the automation potential. Other methods to demonstrate viral RNA or antigens such as immunohis-tology or in situ hybridisation appear not to be sensitive enough to detect subclinical infections. On the other hand, RT-PCR techniques and especially nested RT-PCR, are very sensitive, but bear a high contamination risk. This is probably the cause for the controversial results and opinions published on BDV-infections in animals an man (for review see Stäheli et al 2000).
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Projektziele
(Deutsch)
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Folgende Ziele sollen erreicht werden:
Aufbau einer TaqMan® RT-PCR fuer den Nachweis von BDV-RNA. Dazu gehört die Auswahl von geeigneten Primern.
Validierung der Methode unter Verwendung von infizierten bzw. nicht-infizierten Zellkulturen sowie vorhandenem Gehirngewebe von durch IHC und RT-PCR bestätigten BD Fällen.
Quantifizierung des Virus-loads in Blut- und Gewebeproben unter Verwendung einer Zellspezifischen RNA (18S ribosomale RNA) als Vergleichsmass.
Anwendung der Methode an Blut, Liquor und Sekreten von Pferden und Schafen/Ziegen die an klassischer BD leiden sowie an weiteren Tieren des betroffenen Bestandes.
Untersuchung von Gehirngewebe von Pferden, Eseln, Schafen und Rindern aus dem Borna Endemiege-biet (aus früheren Untersuchungen und neu zu sammeln). (Wir sind auch daran, Gehirne von Feldmäusen und von Hühnern aus dem Endemiegebiet zu sammeln.)
Fernziel ist klar die Etablierung einer sensitiven Methode zur Erfassung von Minimalmengen von Virus-RNA in Geweben von inapparent infizierten Tieren (möglichen Vektoren), unter Vermeidung von Kontaminationen.
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Abstract
(Deutsch)
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Es gelang, mit der TaqMan RT PCR Methode BDV RNA in Zellkulturen und Geweben spezifisch nachzuweisen. Die Spezifität wurde gegenüber verwandter Virusarten (Parainfluenza, Hundestaupe, Tollwut und porcine Coronaviren, PED) überprüft. Die Methode ist sehr sensitiv: In Verdünnungreihen konnten 10 Moleküle bzw. 1 infizierte Zelle in 1einer Million nicht infizierter Zellen nachgewiesen werden. Auch in gefrorenem Zustand gelagertem Gewebe konnte das Virus zuverlässig und sensitiv detektiert werden. Der Nachweis in fixiertem und in Paraffin eingebettetem Gewebe hingegen gelang nicht.
In Zusammenarbeit mit Dr. Lise Gern, Institut de Zoologie, Laboratoire de Parasitologie, Université de Neuchâtel konnten Zecken mit virusinfizierten Zellen künstlich gefüttert werden. Die Zecken wurden nach Intervallen von 1 bis 24 Tagen getötet und mit der Taq Man Methode untersucht. Virus-RNA konnte über die ganze Beobachtungszeit in den Zecken immer wieder detektiert werden, wenngleich in sehr geringen Mengen. Im Gegensatz zu den Gewebeproben infizierter Pferde und Schafe war das p40 / p24 -Verhältnis bei den Zecken grösser als 1, was in Analogie zu Untersuchung an Zellkulturen für eine aktive Virusreplikation spricht.
Die Real Time PCR für den Nachweis von BDV RNA eröffnet uns nun neue Möglichkeiten für weitere Untersuchung an potentiellen Vektoren und auch an Patienten und rekonvaleszenten (Ausscheidung von Virus in Sekreten, Blut etc.).
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Abstract
(Englisch)
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Borna Disease is a severe, immunopathological disorder of the central nervous system (CNS), caused by infection with Borna Disease virus (BDV). The main known naturally affected animal species are horses and sheep in endemic areas in central Europe. The detection of BDV in these hosts is achieved by histological, immunohistochemical and serological approaches and/or PCR-based technologies.
In this study, we present the successful establishment of TaqMan® Real Time PCR for the detection of the transcripts of the two major proteins, p40 (nucleoproteinprotein) and p24 (phosphoprotein). The primers detect BDV with high specificity and the approach also proved to be highly sensitive to detect both, plasmids containing the p40 ORF and BDV from infected MDCK cells. In addition, Real Time PCR allowed the relative quantification of virus load from different sheep and horse brain sites. These data were in complete agreement with previous immunohistochemi-cal studies using the same samples and therefore demonstrated that the TaqMan® PCR approach is a valuable diagnostic and epidemiologic tool, which allows for comparative studies using infected samples from various sources, e.g., different tissues, body fluids and excretions (i.e., liquor, serum, urine). In addition, we tested the hypothesis whether the tick species Ixodes ricinus is a potential vector for the transmission of BDV. Our results show, that BDV infected cells could be detected over a period of one trough 24 days post feeding. However, in the course of time the virus load per tick decreased close to background. Our observations do not necessarily argue for or against ticks being vectors for BDV, but the experiments indicate that the newly established Real Time PCR may provide a useful tool for detecting such vectors in endemic areas.
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Publikationen / Ergebnisse
(Deutsch)
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Zugehörige Dokumente
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Publikationen / Ergebnisse
(Englisch)
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Schindler, A.R., (2004). Real Time RT-PCR for tracing and quantification of Borna Disease Virus RNA in diseased hosts compared to experimentally inoculated ticks. Dissertation Vetsuisse Fakultät Zürich.
Schindler, A.R., Vögtlin, A., Hilbe, M., Zlinszky, K., Ackermann, M., Ehrensperger, F. (2003). Detection of Borna Disease Virus by Real Time PCR (TaqManâ). Posterpräsentation an der Jahrestagung der ESVP 2003 Dublin
A.R. Schindler, A. Vögtlin, M. Hilbe, M. Puorger, K. Zlinszky, M. Ackermann and F. Ehrensperger (2007). Reverse transcription real-time PCR assays for detection and quantification of Borna disease virus in diseased hosts, Mol Cell Probes. 2007 Feb;21(1):47-55.
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