Kurzbeschreibung
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Obwohl in der Schweiz und Mitteleuropa seit Jahren keine Maul- und Klauenseuche (MKS) mehr aufgetreten ist, besteht nach wie vor die Gefahr das MKS-Virus (MKSV) einzuschleppen, da im südöstlichen Europa (Türkei, Albanien, Griechenland, Bulgarien) und in Nordafrika (Algerien, Tunesien) erst vor kurzem MKS aufgetreten ist. Da in der Schweiz nicht mehr gegen MKS geimpft wird, ist es besonders wichtig, über eine gute, schnelle Labordiagnostik zu verfügen. An unserem Institut verfügen wir mit der MKS-RT-PCR über ein schnelles MKSV-Nachweisverfahren. Mit dem Virusnachweis in Zellkultur haben wir ein sensitives, aber zeitaufwendiges Verfahren. Zudem ist das MKSV sehr labil und kann seine Infektiosität rasch verlieren und ist somit nicht mehr mittels Zellkultur nachzuweisen. Wir haben weiter die Möglichkeit, einen zwar schnellen Antigen- Nachweis mittels ELISA durchzuführen, dieser ist aber nicht sehr sensitiv und eignet sich zuverlässig nur für bereits durch eine Zellkulturpassage angereichertes Virus, was die Diagnosestellung verzögert.
Die RT-PCR, über die wir bereits verfügen, wurde im Rahmen der Dissertation F. Locher 1992/93 in der Routinediagnostik etabliert. Zur Primer-Auswahl standen dazumal nur Gensequenzen von wenigen MKSV aus den Datenbanken zur Verfügung. Mittlerweile sind die Gensequenzen von sehr vielen verschiedenen MKSV aller Serotypen auf den Gendatenbanken deponiert. Neuere Nachforschungen unsererseits ergaben, dass mit den 1992 gewählten Primern nur ein Teil der neusten MKSV-Isolate erkannt werden können. Seit 1999 verfügen wir über die neue TaqMan PCR-Technologie, durch die sowohl die Spezifität als auch die Sensitivität der PCR gesteigert werden kann; ein weiterer wichtiger Vorteil ist, dass Kontaminationsprobleme drastisch reduziert werden können, da das PCR-Reaktionsgefäss am Schluss (amplifizierte DNA) nicht mehr zur Analyse geöffnet werden muss. Zusätzlich kann durch die Einführung einer internen Kontrolle (Multiplex-PCR) die Zuverlässigkeit der Reaktion überprüft werden.
Anhand möglichst aller bis jetzt bekannten Gensequenzen möchten wir eine MKS-RT-PCR auf dem TaqMan System entwickeln und validieren die auch die neueren MKSV-Isolate erfasst und eine schnelle Serodifferenzierung erlaubt.
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Projektziele
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Bei der MKSV-Diagnostik ist die RT-PCR als schnelle Nachweismethode sehr wichtig. Zur Etablierung der neuen und verbesserten Methode werden wir die verschiedenen MKSV-Isolate, die wir bereits an unserem Institut haben, testen. Im Rahmen unserer internationalen Zusammenarbeit wollen wir zusätzliche Isolate beschaffen und ebenfalls testen. Mit aus am IVI 1999 durchgeführten Tierversuchen (L. Bruckner Impfstoff-kontrolle) stammendem Material haben wir zusätzlich die Möglichkeit, die Testzuverlässigkeit auch an Organmaterial zu prüfen.
Folgende Untersuchungen und Verbesserungen sollen durchgeführt bzw. eingeführt werden:
- Einführung einer TaqMan RT-PCR die alle MKS-Serotypen erfasst.
- Einführung von typenspezifischen (A,O,C, Asia, SAT) TaqMan Gensonden um bei einem positiven MKSV-Nachweis die Typenbestimmung vorzunehmen.
- Einführung einer internen Kontrolle um Hemmungen in der RT-PCR zu erkennen.
- Prüfung der Sensitivität der neuen RT-PCR verglichen mit der am IVI vorhandenen RT-PCR und der Virusisolation auf Zellkulturen sowie dem Antigen-ELISA.
- Prüfung der Spezifität durch Ausschluss einer Kreuzreaktivität mit anderen differentialdiagnostisch wichtigen Viren (SVD, BVDV, VSV, BKF) bzw. dem MKSV nahe verwandten anderen Enteroviren.
- Die zu amplifizierende Genomregion soll so gewählt werden, dass diese in einem Bereich liegt, wo das EU- bzw. O.I.E. MKS-Referenzlabor Sequenzierdaten zu den jeweils aktuell zirkulierenden MKSV-Stämmen liefert. Somit besteht die Möglichkeit zu überprüfen, ob mindestens theoretisch unsere Primer diese Sequenzen auch erkennen.
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Abstract
(Deutsch)
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Resultate
RT-PCR's, die alle Serotypen erfassen:
In einem ersten Schritt wurden bereits publizierte PCR-Primer (Callen und De Clercq; Reid et al.) bezüglich ihrer Tauglichkeit für das TaqMan-System überprüft. Da eine PCR mittels TaqMan nicht nur zwei passende Primer in einem optimalen Abstand, sondern zusätzlich eine an das amplifizierte Genomfragment bindende fluoreszierende TaqMan-Sonde benötigt, müssen zusätzliche Faktoren berücksichtigt werden, so dass unter Umständen völlig neue Primer gesucht werden müssen. Es fanden sich keine idealen Sondenregionen, bzw. die mit den publizierten Primer erhaltenen PCR-Fragmente waren zu gross, um eine effiziente TaqMan RT-PCR zu etablieren. Aus diesem Grund wurde eine konventionelle PCR mit den publizierten Primern und einem, an die am IVI verwendeten PCR-Methoden, adaptiertes Versuchsprotokoll etabliert. Diese RT-PCR amplifiziert ein ca. 600 bp langes Fragment im der 5' NTR und erkennt alle Serotypen. Die RT-PCR wurde nach unserem Standard validiert. Wir erhielten dazu vom O.I.E. Referenzlabor in Pirbright vermehrungsfähiges Virus aller 7 Serotypen. Ebenso wurde sie an Organ- bzw. Aphtenmaterial aus Tierversuchen am IVI getestet. Die Validierung ergab, dass diese RT-PCR ebenso sensitiv (Serotyp O, A), je nach Serotyp sogar deutlich sensitiver war (Asia1), als die bereits am IVI vorhandene RT-PCR. Im Gegensatz zur bisher am IVI verwendeten RT-PCR nach Locher et al. erkennt die neue Methode auch alle SAT Serotypen. Die RT-PCR erwies sich für mehrere Virusstämme als beträchtlich sensitiver als die Zellkultur, unter anderem auch für den in Grossbritannien aufgetretenen O PanAsia Virusstamm. Eine Kreuzreaktivität mit anderen differentialdiagnostisch wichtigen Viren (SVD, BVDV, VSV, BKF) bzw. den MKSV nahe verwandten anderen Enteroviren konnte nicht beobachtet werden.
Da sich wie oben erwähnt keine bereits publizierte RT-PCR eignete, um auf dem TaqMan-System etabliert zu werden, wurde in einem zweiten Schritt neue Primer und eine Sonde für eine TaqMan RT-PCR, die alle MKSV-Serotypen erfassen sollte, entworfen. Diese PCR funktioniert, allerdings nicht mit allen Virusisolaten gleich gut, so zeigt sie eine ausgesprochen schlechte Reaktivität mit dem Virusisolat O PanAsia aus Grossbritannien. Die Validierung dieser PCR ist erst rudimentär vorhanden, da wir mit immer öfters auftretenden Kontaminationsproblemen zu kämpfen hatten.
Serotyp-spezifische RT-PCR:
Nach den MKS-Ausbrüchen in Grossbritannien etablierten wir sofort eine auf den O PanAsia Virusstamm zugeschnittene TaqMan RT-PCR. Diese erkennt nur O Serotypen, wobei die Reaktivität mit dem UK2001 Virus am besten war.
Den Plan, eine TaqMan RT-PCR mit serotypspezifischen Primern und/oder Sonden für weitere Serotypen zu entwickeln, gaben wir vorläufig auf, da es nicht möglich war in der VP1 Region Bindungsstellen für Primer und Sonden zu finden, die sich erstens von Serotyp zu Serotyp unterschieden, zweitens innerhalb eines Serotyps konserviert waren und drittens ein für die TaqMan RT-PCR optimales kurzes PCR Fragment liefern. Die VP1 Region wurde gewählt, weil das O.I.E./FAO MKS-Referenzlabor regelmässig Sequenzdaten aus dieser Region von neu typisierten MKSV-Stämmen publiziert.
Wir konnten aber durch die Entwicklung der erwähnten O PanAsia-spezifischen TaqMan RT-PCR Erfahrungen sammeln, so dass wir bei einem MKS-Ausbruch innert kurzer Zeit eine für den aktuell zirkulierenden Virusstamm empfindliche TaqMan RT-PCR etablieren können, sobald Sequenzen bekannt sind. Somit wären wir auch für einen allfälligen grossen Probendurchsatz gerüstet.
Die geplante Entwicklung einer SYBRGreen RT-PCR auf dem TaqMan-System wurde vorerst fallen gelassen, weil Lieferschwierigkeiten bei der dazu nötigen Software bestanden. Die SYBRGreen PCR ergibt für jeden MKSV-Serotyp - durch die unterschiedliche PCR-Fragmentlänge und -sequenz bedingt - eine typische Schmelzpunktkurve. Die Software wäre nun vorhanden, wir nehmen aber diesen Lösungsansatz vorläufig nicht mehr auf und werden für die Serotypendifferenzierung eher auf die Sequenzierung der PCR-Fragmente, die wir bei der konventionellen 5'NTR RT-PCR erhalten, setzen.
Das Ziel war ursprünglich, mindestens die Serotypen A, O, C mit einer RT-PCR unterscheiden zu können. Da die Schweiz von der heutigen Seuchenlage aus betrachtet aber am ehesten mit den Serotypen A, O und Asia1 konfrontiert würde, entschieden wir uns, den 2000 zum letzten Mal in Kenia aufgetretenen Serotyp C nicht mehr zu berücksichtigen. Für die oben erwähnten Serotypen übernahmen wir Primerdaten aus bereits publizierten RT-PCRs (Vangrysperre and De Clercq; Callens and De Clercq) und testeten sie mit unseren PCR-Protokollen. Die Resultate waren für die Serotypen A und Asia1 befriedigend, d.h. eine Unterscheidung war möglich und die Sensitivität war akzeptabel. Für die Serotypen SAT1-3 muss noch eine PCR Optimierung durchgeführt werden, da Kreuzreaktionen mit anderen Serotypen festgestellt wurden. Die PCR für den Serotyp O funktioniert, leider aber nicht für alle getesteten Isolate gleich gut, d.h. bei gewissen Isolaten ist die Sensitivität schlecht. All diese serotypspezifischen RT-PCRs sind noch nicht nach unseren Anforderungen validiert. Ursache der unvollständigen Validierung waren einerseits die z.T. massiven Kontaminationsprobleme in den TaqMan RT-PCRs, die uns sehr viel Zeit gekostet haben, andererseits die minimale Begeisterungsfähigkeit der auf dem Projekt arbeitenden Postdoktorandin.
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