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Forschungsstelle
BLV
Projektnummer
1.98.04
Projekttitel
Validierung der kompetitiven RT-PCR für die Analyse der Zytokinprofile beim Rind

Texte zu diesem Projekt

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Schlüsselwörter
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Erfasste Texte


KategorieText
Schlüsselwörter
(Deutsch)
Rind, Immunologie, Bovine Viral Diarrhoea Virus (BVDV), Zytokine, IFN-g, IL-4, competitive quantitative RT-PCR (cqRT-PCR), Trächtigkeit
Kurzbeschreibung
(Deutsch)
In der Immunologie lassen sich die zwei Typen von Immunantworten (1 und 2) unterscheiden auf Grund der Zytokine, welche stimulierte Lymphozyten sezernieren. Die Typ 1 Antwort geht mit einer zellulären Immunantwort und Entzüdung, die Typ 2 Antwort mit einer humoralen Immunantwort oder Allergie einher. Vom Zusammenspiel der beiden Typen hängt es ab, ob ein Erreger effizient eliminiert wird und ob einerseits die entzündliche Reaktion in Grenzen gehalten werden kann und andererseits eine allergische Reaktion vermieden werden kann. Ob ein Individuum mit einer Typ 1 oder Typ 2 Antwort reagiert hängt von der Art und Menge des Antigens und weiteren Faktoren ab. Sie kann zum Beispiel durch eine Trächtigkeit in Richtung Typ 2 gelenkt werden. Für die Beurteilung der Rolle von Antigenen bei Impfungen oder experimentellen Infektionen oder des Einflusses der Trächtigkeit auf die Art der Immunantwort muss man in der Lage sein, die entsprechenden Zytokine nachzuweisen. Eine relativ effiziente Methode dazu ist der Nachweis und die Quantifizierung der mRNA. Deshalb soll in dieser Arbeit am Modell der Immunität gegen BVDV die Brauchbarkeit des Nachweises der mRNA von Zytokinen durch kompetitive RT-PCR zur Beurteilung des Types der Immunantwort geprüft werden, indem mit Hilfe diesr Technik der Einfluss der Trächtigkeit auf den Typ der Immunantwort untersucht wird.
Projektziele
(Deutsch)
- Etablierung der cRT-PCR für den Nachweis der Zytokine IL-4 und IFNgamma beim Rind
- Prüfung der Verwendungsmöglichkeit der cRT-PCR unter Feldbedingungen am Modell der Immunantwort gegen BVDV
- Durch den Vergleich der Menge der mRNA für INFgamma mit der druch ELISA nachweisbaren Menge INFgamma soll festgestellt werden, ob eine Zytokin-Bestimmung durch die cRT-PCR eine korrekte Aussage in Bezug auf die Zytokinexpression von Lymphozyten erlaubt.
Abstract
(Deutsch)
Die Effizienz der Elimination eines Erregers und das Ausmass der Schäden, welche bei dieser Immunantwort entstehen, sind wichtige Determinanten für den Verlauf einer Infektionskrankheit. Helfer T Zellen, insbesondere Th1 und Th2 Zellen, spielen in diesem Zusammenhang eine wichtige Rolle. Th1 Zellen fördern eine zelluläre Immunantwort und Entzündung, indem sie bestimmte Zytokine wie IFN-g sezernieren, und Th2 Zellen unterstützen eine humorale Immunantwort oder anaphylaktische Reaktion, indem sie unter anderem IL-4 sezernieren. Eine Trächtigkeit bei der Maus, bzw. eine Schwangerschaft bei der Frau, kann das Muster der Zytokinsekretion in Richtung Th2 verschieben, was den Verlauf einer Infektions- oder Autoimmunkrankheit be-einflussen kann. Die Bestimmung und Quantifizierung von Zytokinen ist deshalb ein wertvolles Mittel für Unter-suchungen der Pathogenese von Infektionskrankheiten, zum Beispiel des Einflusses einer Trächtigkeit auf den Verlauf einer Infektion. Da einerseits für die veterinärmedizinisch relevanten Spezies ELISA Tests, welche zur Quantifizierung der Zytokine in der humanen und murinen Immunologie verwendet werden, weitgehend fehlen, jedoch auf der andern Seite die Nukleotidsequenzen von zahlreichen tierischen Zytokinen bekannt sind, wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob die Quantifizierung der mRNA mittels der kompetitiven quantitativen RT-PCR (cqRT-PCR) für die Untersuchung von Tieren in einer klinischen Studie anwendbar sei. Gleichzeitig wurde der Frage nachgegangen, ob eine Trächtigkeit den Typ der Immunantwort auch beim Rind beeinflusst.
Zusammenfassung
Siebenundvierzig Rinder und Kühe, vierzehn Monate bis dreizehn Jahre alt, wurden in diese Untersuchung miteinbezogen. Fünfundzwanzig davon waren seropositiv, der Rest seronegativ für BVDV. Zwölf seropositive und elf seronegative Kühe waren im achten Trächtigkeitsmonat. Die übrigen Rinder waren nichtträchtige Rinder. Periphere mononukleäre Blutleukozyten (PBMC) dieser Tiere wurden stimuliert mit einem nicht-zytopathogenen Stamm von BVDV (ncpBVDV). Die Menge IFN-g wurde mittels eines kommerziell erhältlichen ELISA kits und die mRNA Expression von IFN-g und IL-4 mittels cqRT-PCR bestimmt.
Zwischen den ELISA Werten und der mRNA Expression von IFN-g bestand eine hoch signifikante positive Korrelation, wobei bei sechzehn Tieren die IFN-g Spiegel unter der Nachweisgrenze lagen und nur mittels der cqRT-PCR das Zytokin nachweisbar war. Sowohl IFN-g als auch IL-4 mRNA Spiegel waren bei den BVDV seropositiven Tieren signifikant höher als bei den seronegativen Tieren. Hingegen konnte kein Unterschied zwischen trächtigen und nichtträchtigen Tieren in Bezug auf diese Zytokine festgestellt werden.
Ergebnisse und Bedeutung
Mittels der cqRT-PCR war es möglich bei einer grösseren Anzahl von Tieren die Zytokinproduktion in PBMCs zu analysieren. PBMCs von seropositiven Tieren reagierten mit deutlich erhöhter Expression von IFN-g und IL-4 mRNA auf eine Stimulation mit ncpBVDV. Ein Unterschied zwischen trächtigen und nichtträchtigen Tieren war hingegen nicht feststellbar und es war nicht möglich auf Grund unserer Resultat Rückschlüsse auf den Typ der Zellen, welche die Zytokine produzierten, zu ziehen. Dazu müssten Methoden zur Identifizierung der einzelnen zytokinproduzierenden Zellen für das Rind adaptiert werden.
Publikationen / Ergebnisse
(Deutsch)
Hediger-Weithaler, B. (1999) Interferon-g and IL-4 mRNA expression by PBMCs from BVDV seropositive pregnant and nonpregnant cattle. Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktortitels der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Bern.

Dasselbe Manuskript wurde zur Publikation in Veterinary Immunology and Immunopathology eingereicht.